Μελέτη της σταθερότητας DNA φυτικών κυττάρων σε φυσικούς βαθέως ευτηκτικούς διαλύτες

Παυλοπούλου, Καλλιόπη Έλλη; Pavlopoulou, Kalliopi Elli

dc.contributor.author	Παυλοπούλου, Καλλιόπη Έλλη	el
dc.contributor.author	Pavlopoulou, Kalliopi Elli	en
dc.date.accessioned	2023-01-05T12:04:35Z
dc.identifier.uri	https://dspace.lib.ntua.gr/xmlui/handle/123456789/56535
dc.identifier.uri	http://dx.doi.org/10.26240/heal.ntua.24233
dc.rights	Αναφορά Δημιουργού-Μη Εμπορική Χρήση-Όχι Παράγωγα Έργα 3.0 Ελλάδα	*
dc.rights	Αναφορά Δημιουργού-Μη Εμπορική Χρήση-Όχι Παράγωγα Έργα 3.0 Ελλάδα	*
dc.rights.uri	http://creativecommons.org/licenses/by-nc-nd/3.0/gr/	*
dc.subject	Απομόνωση DNA	el
dc.subject	Φυτικά κύτταρα	el
dc.subject	Φυσικοί βαθέως ευτηκτικοί διαλύτες	el
dc.subject	Σταθερότητα DNA	el
dc.subject	Αλληλεπίδραση ct-DNA	el
dc.subject	DNA extraction	en
dc.subject	Plant cells	en
dc.subject	Natural deep eutuctic solvents	en
dc.subject	DNA stability	en
dc.subject	ct-DNA interaction	en
dc.title	Μελέτη της σταθερότητας DNA φυτικών κυττάρων σε φυσικούς βαθέως ευτηκτικούς διαλύτες	el
heal.type	bachelorThesis
heal.classification	Πράσινη χημεία	el
heal.classification	Βιοτεχνολογία	el
heal.classification	Biotechnology	en
heal.classification	Green chemistry	en
heal.dateAvailable	2024-01-04T22:00:00Z
heal.language	el
heal.access	embargo
heal.recordProvider	ntua	el
heal.publicationDate	2022-10-03
heal.abstract	Το DNA, από τη στιγμή της ανακάλυψής του μέχρι και σήμερα, αποτελεί ερευνητικό κόμβο για πολλές επιστήμες. Όντας ο ακρογωνιαίος λίθος στην κατανόηση των όλων των έμβιων οργανισμών, και δη του ανθρώπου, η καθαρότητά του και η βέλτιστη συντήρησή του είναι βαρύνουσας σημασίας. Η απορρόφηση του DNA στο φάσμα ορατού-υπεριώδους και συγκεκριμένα ο λόγος απορρόφησης στα 260 nm προς αυτήν στα 280 nm είναι ενδεικτικός για την ταυτότητα και την σταθερότητα του μακρομορίου (ύπαρξη προσμίξεων, αποδόμηση). Ιδιάζουσα ιδιότητα του DNA είναι και η αλληλεπίδρασή του με διάφορες ενώσεις. Η δράση της εκάστοτε ένωσης μπορεί να είναι αποσταθεροποιητική ή σταθεροποιητική με άμεσες επιπτώσεις στην σταθερότητα και την συντήρηση του γενετικού υλικού. Στην παρούσα εργασία διερευνάται η ανάπτυξη μιας πράσινης διεργασίας για την εκχύλιση του DNA από φυτικά κύτταρα μπανάνας (Musa Acuminata) και η βελτιστοποίησή της ως προς τις σημαντικότερες παραμέτρους. Παράλληλα, μελετάται η επίδραση των φυσικών βαθέως ευτηκτικών διαλυτών (NaDESs) στην σταθερότητα του απομονωμένου DNA. Τα βέλτιστα αποτελέσματα εφαρμόζονται στο DNA θύμου αδένα βοδιού (calf thymus DNA, ct-DNA) και σε μελέτες αλληλεπίδρασης. Αρχικά, εξετάστηκαν διάφορα NaDESs ως προς την διαλυτική τους ικανότητα για το DNA και βρέθηκε κατάλληλο το NaDES με συστατικά τη βεταΐνη και τη γλυκερόλη (Bet-Gly) σε αναλογία 1:2, καθώς διαθέτει τα κατάλληλα φυσικοχημικά χαρακτηριστικά (pH, πολικότητα). Στη συνέχεια, στην διεργασία απομόνωσης του DNA, πραγματοποιήθηκε πειραματικός σχεδιασμός για την μελέτη της επίδρασης 3 παραμέτρων σε 3 αποκρίσεις (Box Behnken 3x3). Συγκεκριμένα, ως ανεξάρτητες μεταβλητές μελετήθηκαν η συγκέντρωση άλατος (M) στο διάλυμα λύσης των κυττάρων, η συγκέντρωση αιθανόλης (% v/v) στο διάλυμα ανάδυσης του DNA και τέλος η συγκέντρωση του NaDES Bet-Gly 1:2 (% v/v) στο διάλυμα αποθήκευσης του απομονωμένου DNA. Οι εξαρτημένες μεταβλητές που παρακολουθήθηκαν ήταν η ποσότητα του απομονωμένου DNA (mg), η καθαρότητά του (Α260/Α280) και η σταθερότητά του (d). Η βελτιστοποίηση του μοντέλου έδειξε ότι οι κατάλληλες τιμές των μεταβλητών για τις μέγιστες αποκρίσεις είναι: [NaCl] = 0.51 M, EtOH = 70 % v/v, NaDES Bet-Gly: 1 % v/v. Το μοντέλο αυτό επιβεβαιώθηκε και πειραματικά. Επιπροσθέτως, μέρος του απομονωμένου φυτικού DNA χρησιμοποιήθηκε για χαρακτηρισμούς με χρήση φασματοφωτομετρίας υπερύθρου με μετασχηματισμό Fourier (FT-IR) και δυναμικής σκέδασης φωτός (DLS). Ακολούθως, το βέλτιστο υδατικό διάλυμα 1% NaDES Bet-Gly 1:2, χρησιμοποιήθηκε σε μελέτη σταθερότητας ct-DNA. Τα αποτελέσματα συγκρίθηκαν με αντίστοιχη διάλυση του ct-DNA σε διάλυμα Tris-HCl pH 7.4 και το αντίστοιχο φυσικό μίγμα του 1% NaDES Bet-Gly 1:2. Το NaDES έδειξε εξαιρετική συντηρητική ικανότητα η οποία μπορεί να συγκριθεί με αυτή του συμβατικού ρυθμιστικού διαλύματος Tris-HCl. Επιπροσθέτως, διενεργήθηκε μελέτη αλληλεπίδρασης του ct-DNA με το 1% NaDES Bet-Gly 1:2 και τα αποτελέσματα έδειξαν την σταθεροποιητική δράση που προσφέρει και ενισχύει την καλή συντηρητική ικανότητα που προσφέρει (ερυθρή μετατόπιση και Kb,NaDES = 1.85⸱10^3 M-1). Μελέτη αλληλεπίδρασης πραγματοποιήθηκε και με το ct-DNA και το ασκορβικό οξύ συγκριτικά για την περίπτωση διάλυσης σε 1% NaDES Bet-Gly 1:2 (Kb,Ascorbic,NaDES = 3.23⸱10^3 M-1) και την περίπτωση διάλυσης σε ρυθμιστικό διάλυμα Tris-HCl pH 7.4 (Kb,Ascorbic,Tris = 3.09⸱10^3 M-1). Τα αποτελέσματα ήταν συγκρίσιμα και έτσι το NaDES μπορεί να χρησιμοποιηθεί και σε παρόμοιες μελέτες.	el
heal.abstract	DNA, from the moment of its discovery until today, is a research hub for many sciences. Being the cornerstone in the understanding of all living organisms, especially humans, its purity and optimal preservation are of paramount importance. The absorption of DNA in the visible-UV spectrum, and specifically the ratio of absorption at 260 nm to that at 280 nm, is indicative of the identity and stability of the macromolecule (presence of impurities, degradation). A peculiar property of DNA is its interaction with various compounds. The action of each compound can be destabilizing or stabilizing with direct effects on the stability and maintenance of the genetic material. In the present work, the development of a green process for the extraction of DNA from plant cells (Musa Acuminata) and its optimization in terms of the most important parameters are investigated. At the same time, the effect of natural deep eutectic solvents (NaDESs) on the stability of isolated DNA is studied. Best results are applied to ct-DNA and interaction studies. Initially, various NaDESs were investigated for their ability to solubilize DNA and NaDES Bet-Gly 1:2 was found to be suitable as it has the appropriate characteristics (pH, polarity). Then, in the DNA isolation process, an experimental design was carried out to study the effect of 3 parameters on 3 responses (Box Behnken 3x3). Specifically, the salt concentration (M) in the cell lysis solution, the ethanol concentration (% v/v) in the DNA extraction solution and finally the concentration of NaDES Bet-Gly 1:2 (% v/v) were studied as independent variables. in the storage solution of the isolated DNA. The dependent variables monitored were the amount of DNA isolated (mg), its purity (A-260¬/A¬280¬) and its stability (d). Optimization of the model showed that the appropriate values of the variables for maximum responses are: [NaCl] = 0.51 M, EtOH = 70 % v/v, NaDES Bet-Gly: 1 % v/v. This model was subsequently confirmed by conducting appropriate experiments. Additionally, part of the isolated plant DNA was used for FT-IR and DLS measurements. Next, the optimal 1% NaDES Bet-Gly 1:2 aqueous solution was used in a ct-DNA stability study. The results were compared with corresponding dissolution of ct-DNA in Tris-HCl solution pH 7.4 and the corresponding natural mixture of 1% NaDES Bet-Gly 1:2. NaDES showed excellent preservative ability which can be compared with that of conventional Tris-HCl buffer. In addition, an interaction study of ct-DNA with 1% NaDES Bet-Gly 1:2 was carried out and the results showed the stabilizing effect it offers and enhances the good preservative ability it offers (red shift and Kb,NaDES = 1.85⸱10^3 M-1). An interaction study was also carried out with ct-DNA and ascorbic acid comparing the case of dissolution in 1% NaDES Bet-Gly 1:2 (Kb,Ascorbic,NaDES = 3.23⸱10^3 M-1) and the case of dissolution in buffer solution Tris-HCl pH 7.4 (Kb,Ascorbic,Tris = 3.09⸱10^3 M-1). The results were comparable and thus NaDES can also be used in similar studies.	en
heal.advisorName	Δέτση, Αναστασία	el
heal.committeeMemberName	Τόπακας, Ευάγγελος	el
heal.committeeMemberName	Κοκόσης, Αντώνης	el
heal.academicPublisher	Εθνικό Μετσόβιο Πολυτεχνείο. Σχολή Χημικών Μηχανικών. Τομέας Χημικών Επιστημών (I)	el
heal.academicPublisherID	ntua
heal.numberOfPages	113 σ.	el
heal.fullTextAvailability	false