Έκφραση και απομόνωση ενζύμων με λιγνινολυτικές ιδιότητες

Γρηγοράκης, Κωνσταντίνος; Grigorakis, Konstantinos

dc.contributor.author	Γρηγοράκης, Κωνσταντίνος	el
dc.contributor.author	Grigorakis, Konstantinos	en
dc.date.accessioned	2023-01-11T10:51:57Z
dc.date.available	2023-01-11T10:51:57Z
dc.identifier.uri	https://dspace.lib.ntua.gr/xmlui/handle/123456789/56610
dc.identifier.uri	http://dx.doi.org/10.26240/heal.ntua.24308
dc.rights	Αναφορά Δημιουργού-Μη Εμπορική Χρήση 3.0 Ελλάδα	*
dc.rights.uri	http://creativecommons.org/licenses/by-nc/3.0/gr/	*
dc.subject	Λιγνίνη	el
dc.subject	Ετερόλογη έκφραση	el
dc.subject	Ένζυμα	el
dc.subject	Pichia pastoris	el
dc.title	Έκφραση και απομόνωση ενζύμων με λιγνινολυτικές ιδιότητες	el
dc.title	Expression and isolation of ligninolytic enzymes	en
heal.type	bachelorThesis
heal.classification	Βιοτεχνολογία	el
heal.language	el
heal.access	free
heal.recordProvider	ntua	el
heal.publicationDate	2022-09-23
heal.abstract	Η λιγνοκυτταρινούχος βιομάζα αποτελεί την πιο άφθονη ανανεώσιμη πρώτη ύλη στον πλανήτη.1 Παράγεται από ατμοσφαιρικό διοξείδιο του άνθρακα και νερό με την βοήθεια ηλιακής ενέργειας κατά την φωτοσύνθεση των φυτών. Μεγάλες ποσότητες λιγνοκυτταρινούχου βιομάζας απορρίπτονται ετησίως από διάφορες ανθρώπινες δραστηριότητες και καταλήγουν να καίγονται αναξιοποίητες,2 ενώ θα μπορούσαν να βιοαποικοδομηθούν μέσω λιγνολυτικών ενζυμικών συστημάτων. Τέτοια συστήματα μπορούν να αυξήσουν την αξιοποίησή της σε διεργασίες παραγωγής βιοκαυσίμων, βιοπλαστικών και άλλων υλικών, και πιο πρόσφατα ακόμα να αξιοποιηθούν στην βιοαποικοδόμηση πλαστικών, λόγω της πολυμερικής φύσης των τελευταίων.3 Η λιγνοκυτταρινούχος βιομάζα αποτελείται στο μεγαλύτερο μέρος της από μία ισχυρά σταυροδεμένη ετερογενή μήτρα ημικυτταρίνης και λιγνίνης, που εγκλείει μικροϊνίδια κρυσταλλικής κυτταρίνης. Η μήτρα αυτή συγκρατείται μεταξύ άλλων από β – Ο – 4 αιθερικούς δεσμούς οι οποίοι συνδέουν όχι μόνο ετερομονομερή λιγνίνης μεταξύ τους αλλά και την πολυμερική λιγνίνη με την ημικυτταρίνη. Οι έως τώρα χαρακτηρισμένες βακτηριακές αιθεράσες, που υδρολύουν τέτοιους δεσμούς, δρουν μόνο ενδοκυτταρικά σε διαλυτά ολιγομερή λιγνίνης που προκύπτουν στην φύση κυρίως από μυκητιακή ενζυμική δράση. Πρόσφατα, απομονώθηκε η πρώτη μυκητιακή αιθεράση (PpETH) που δρά εξωκυτταρικά στην αδιάλυτη λιγνοκυτταρινούχο βιομάζα, και άρα παρουσιάζει αυξημένο βιοτεχνολογικό ενδιαφέρον.4 Σκοπός της παρούσας διπλωματικής εργασίας ήταν η ετερόλογη έκφραση και η απομόνωση τόσο της παραπάνω αιθεράσης όσο και ενός ομόλογου ενζύμου (TcETH) που προέκυψε από αναζήτηση σε παγκόσμιες βάσεις δεδομένων και περιλαμβάνει μια επιπλέον περιοχή στο καρβοξυτελικό της άκρο. Τα γονίδια ενδιαφέροντος ενσωματώθηκαν στον φορέα pPICZα C που χρησιμοποιήθηκε για τον μετασχηματισμό κυττάρων της μεθανότροφης ζύμης Pichia pastoris Χ33, μέσω ηλεκτροδιάτρησης. Ακολούθησε διαλογή των μετασχηματισμένων στελεχών ως προς την ανάπτυξη και την ικανότητα έκφρασης, και για την απομόνωση των ετερόλογων ενζύμων χρησιμοποιήθηκε χρωματογραφία συγγένειας μετάλλου. Τελικά, και τα δύο ένζυμα εκφράστηκαν επιτυχώς σε P. pastoris με όγκο καλλιέργειας 500 mL στους 20 ℃, αλλά στην δεύτερη περίπτωση υπάρχουν ενδείξεις καταβύθισης.	el
heal.abstract	Lignocellulosic biomass is the most abundant resource on the planet. It is produced from atmospheric carbon dioxide and water with the help of the sun’s energy during plant photosynthesis. Large quantities of lignocellulosic biomass are wasted every year from human activities and end up being burnt unexploited, while they could be biodegraded with lignolytic enzyme systems. Such systems have the potential to increase conversion of lignocellulosic biomass in the production of biofuels, bioplastics and other value added materials, and more recently be used in the biodegradation of plastics, due to the polymeric nature of them. Lignocellulosic biomass consists mainly of a strongly crosslinked heterogenous matrix of hemicellulose and lignin that encapsulates crystalline cellulose microfibrils. This matrix is held together mainly with β – Ο – 4 ether bonds that bond lignin monomers and lignin with hemicellulose. Up until now bacterial etherases that hydrolyse such bonds act only intracellularly in soluble lignin oligomers that occur in nature mainly from fungi enzymatic activity. Recently, the first fungal etharase (PpETH) that acts extracellularly on insoluble lignocellulosic biomass was isolated and comes with great biotechnological interest. The aim of this study was heterologous expression and isolation of this etherase and a homologous enzyme (TcETH) that was found in global databases and contains an extra domain at its C – terminus. The genes of interest were cloned into the pPICZα C vector that was used to transform methanol-eating Pichia pastoris X33 yeast through electroporation. Screening of transformed strains was carried out through growth and protein expression measurements and immobilized metal affinity chromatography was used to purify the heterologous enzymes. In conclusion, both enzymes were successfully expressed by P. pastoris in cultures of 500 mL at 20 ℃, but there were indications of protein aggregation in the case of TcETH.	en
heal.advisorName	Τόπακας, Ευάγγελος	el
heal.committeeMemberName	Τόπακας, Ευάγγελος	el
heal.committeeMemberName	Μαμμά, Διόμη	el
heal.committeeMemberName	Χαμηλάκης, Στυλιανός	el
heal.academicPublisher	Εθνικό Μετσόβιο Πολυτεχνείο. Σχολή Χημικών Μηχανικών. Τομέας Σύνθεσης και Ανάπτυξης Βιομηχανικών Διαδικασιών (IV)	el
heal.academicPublisherID	ntua
heal.numberOfPages	83 σ.	el
heal.fullTextAvailability	false