Βιοχημικός χαρακτηρισμός καινοτόμων πολυεστερασών με δυνατότητα ενζυμικής αποικοδόμησης πλαστικών.

Τριαντοπούλου, Αφροδίτη; Triantopoulou, Afroditi

dc.contributor.author	Τριαντοπούλου, Αφροδίτη	el
dc.contributor.author	Triantopoulou, Afroditi	en
dc.date.accessioned	2023-01-25T07:02:20Z
dc.date.available	2023-01-25T07:02:20Z
dc.identifier.uri	https://dspace.lib.ntua.gr/xmlui/handle/123456789/56879
dc.identifier.uri	http://dx.doi.org/10.26240/heal.ntua.24577
dc.rights	Default License
dc.subject	Βιοχημικός χαρακτηρισμός, , , , PET, DmEst, LCC, Se1JFR, PETase, PHOase, PUase.	el
dc.subject	Ενζυμική αποικοδόμηση	en
dc.subject	Πολυεστεράσες	el
dc.subject	Πολυεστερικά πλαστικά	el
dc.subject	Biochemical characterization	en
dc.subject	Enzymatic degradation	en
dc.subject	Polyesterases	en
dc.subject	Polyester plastics	en
dc.subject	PHOase	en
dc.subject	PUase	en
dc.subject	PETase	en
dc.subject	Se1JFR	en
dc.subject	DmEst	en
dc.subject	LCC	en
dc.subject	PET	en
dc.title	Βιοχημικός χαρακτηρισμός καινοτόμων πολυεστερασών με δυνατότητα ενζυμικής αποικοδόμησης πλαστικών.	el
dc.title	Biochemical characterization of novel polyesterases capable to degrade plastics.	el
heal.type	bachelorThesis
heal.classification	Βιοτεχνολογία	el
heal.language	el
heal.access	free
heal.recordProvider	ntua	el
heal.publicationDate	2022-09-26
heal.abstract	Η εκτεταμένη χρήση πλαστικών υλικών έχει οδηγήσει σε σημαντικά περιβαλλοντικά προβλήματα λόγω της ανικανότητας βιοαποικοδόμησης και της συσσώρευσής τους. Οι συμβατικοί τρόποι διαχείρισης των πλαστικών απορριμμάτων εμφανίζουν αρκετά μειονεκτήματα και για τον λόγο αυτό γίνονται προσπάθειες εύρεσης νέων τρόπων, πιο φιλικών προς το περιβάλλον, για την αντιμετώπιση της πλαστικής ρύπανσης. Προς αυτήν την κατεύθυνση πραγματοποιούνται αρκετές μελέτες ανακάλυψης ενζύμων που έχουν την ικανότητα να αποικοδομούν πολυμερικά υλικά. Έτσι, σκοπός της παρούσας διπλωματικής εργασίας είναι ο πλήρης βιοχημικός χαρακτηρισμός ενζύμων που έχουν την ικανότητα να αποικοδομούν πλαστικά υλικά και εν συνεχεία η μελέτη της δράσης τους σε αυτά. Έτσι, μελετήθηκε η δράση συνολικά έξι ενζύμων. Τα δύο από αυτά (DmEst και Se1JFR) ανακαλύφθηκαν ύστερα από βιοπληροφορική ανάλυση, ενώ τα υπόλοιπα τέσσερα (LCC, PETase, PHOase και PUase) βρέθηκαν βιβλιογραφικά, με την LCC και την PETase να αποτελούν γνωστές υδρολάσες του τερεφθαλικού πολυαιθυλενίου, οπότε χρησιμοποιήθηκαν ως ένζυμα αναφοράς. Τα πολυμερικά υλικά στα οποία μελετήθηκε η δράση των συγκεκριμένων ενζύμων είναι πολυεστερικά, δηλαδή διαθέτουν εστερικούς δεσμούς στο μόριό τους, οπότε αυτό που μελετήθηκε είναι η υδρόλυση των δεσμών αυτών από τα ένζυμα. Πιο συγκεκριμένα, τα πλαστικά που χρησιμοποιήθηκαν είναι η πολυκαπρολακτόνη (PCL), η πολυουρεθάνη (PU), το πολυγαλακτικό οξύ (PLA), ο πολύ-υδροξυ-βουτυρικός εστέρας (PHB), ο πολύηλεκτρικός βουτυλεστέρας (PBS) και το τερεφθαλικό πολυαιθυλένιο (PET). Τα γονίδια των μελετώμενων ενζύμων εισήχθησαν αρχικά σε πλασμιδιακούς φορείς pET-22b(+) και pET-26b (+) και ακολούθησε η ετερόλογη έκφρασή τους σε επιδεκτικά βακτηριακά κύτταρα Escherichia coli BL21 (DE3) με βάση μοντέλα βελτιστοποίησης έκφρασης. Ακολούθως, πραγματοποιήθηκε ο βιοχημικός χαρακτηρισμός των ενζύμων χρησιμοποιώντας ως υπόστρωμα το pNPB. Συγκεκριμένα, το ένζυμο DmEst εμφάνισε βέλτιστη δράση σε pH=6,0 και Τ= 50 ˚C, παρέμεινε γενικά σταθερό σε μέσες και ελαφρώς αλκαλικές τιμές pH (7,0-9,0) και σε θερμοκρασιακό εύρος 20-50 ˚C, είχε μεγαλύτερη συγγένεια με το υπόστρωμα pNPB και κινητικές σταθερές MichaelisMenten με αυτό ίσες με umax = 59,9 Units/mgprot και Km = 0,1938 mM. Το ένζυμο LCC έδρασε βέλτιστα σε pH=8,5 και Τ=60 ˚C, ενώ ήταν αρκετά σταθερό στο εύρος pH=5,0-10,0 και Τ=20-80 ˚C. Το ένζυμο Se1JFR παρουσίασε βέλτιστη δράση σε pH=7,0 και Τ=35 ˚C, ενώ παρέμεινε σταθερό κυρίως σε μέσες και αλκαλικές τιμές pH (7,0-10,0) και σε θερμοκρασιακό εύρος 20-30 ˚C και εμφάνισε μεγαλύτερη συγγένεια με το υπόστρωμα pNPD. Όσον αφορά το ένζυμο PETase, έδρασε βέλτιστα σε pH=7,0 και Τ=35 ˚C, παρέμεινε σταθερότερο σε αλκαλικές τιμές pH (8,0-10,0) και σε θερμοκρασίες 20-30 ˚C και εμφάνισε μεγαλύτερη συγγένεια με το υπόστρωμα pNPA. Το ένζυμο PHOase εμφάνισε βέλτιστη δράση σε pH=6,0 και Τ=40 ˚C, παρέμεινε γενικά σταθερό στο εύρος pH=5,0-10,0 και σε θερμοκρασιακό εύρος 20-40 ˚C και παρουσίασε μεγαλύτερη συγγένεια με το υπόστρωμα pNPA. Τέλος, το ένζυμο PUase είχε βέλτιστη δράση σε pH=6,0 και Τ=40 ˚C, παρέμεινε σταθερότερο σε μέσες τιμές v pH (6,0-8,0) και σε θερμοκρασίες 20-40 ˚C και εμφάνισε μεγαλύτερη συγγένεια με το υπόστρωμα pNPB. Στη συνέχεια πραγματοποιήθηκαν οι αντιδράσεις των ενζύμων με τα πολυεστερικά πλαστικά, από όπου προέκυψε ότι όλα τα ένζυμα εμφάνισαν ενδείξεις αποικοδόμησης αυτών. Οι αντιδράσεις πραγματοποιήθηκαν σε pH=7,0 και Τ=50 ˚C για τα ένζυμα DmEst και LCC, σε pH=7,0 και Τ=30 ˚C για τα ένζυμα Se1JFR και PETase και σε pH=6,0 και Τ=40 ˚C για τα ένζυμα PHOase και PUase, ενώ όλα τα ρυθμιστικά διαλύματα ήταν φωσφορικών ιόντων 0,1 M. Η χρονική διάρκεια των αντιδράσεων ήταν 3 ημέρες (με εξαίρεση την PCL που ήταν μία ημέρα) και η συγκέντρωση των ενζύμων στις αντιδράσεις ήταν 13 μΜ. Όσον αφορά τα πολυεστερικά πλαστικά πλην του PET τα αποτελέσματα δράσης των ενζύμων μελετήθηκαν με βάση τη διαφορά μάζας του υλικού, ενώ στο PET εκτός της διαφοράς μάζας, μελετήθηκε και η απελευθέρωση προϊόντων υδρόλυσης. Προέκυψε το συμπέρασμα ότι σε όλα τα υλικά πλην του PET το ένζυμο LCC είχε την βέλτιστη δράση έναντι των υπολοίπων ενζύμων με μοναδική εξαίρεση την PU όπου το καλύτερο αποτέλεσμα εμφανίστηκε για την Se1JFR. Ωστόσο, και τα υπόλοιπα ένζυμα είχαν δράση στα πλαστικά που μελετήθηκαν, οδηγώντας στο συμπέρασμα ότι πρόκειται πράγματι για πολυεστεράσες. Όσον αφορά το PET, τα πιο αξιόλογα συμπεράσματα που προέκυψαν είναι η μείωση μάζας που προκάλεσε το ένζυμο Se1JFR στην κρυσταλλική σκόνη, μία μείωση που είναι συγκρίσιμη με αυτήν που προκάλεσε η γνωστή PET-υδρολάση, PETase (Δm=1,3% έναντι Δm=2,3% για την PETase). Ακόμα, αξιοσημείωτη είναι η δράση της DmEst στο συγκεκριμένο υλικό εφόσον προκάλεσε σχεδόν όμοια συγκέντρωση απελευθερωμένων προϊόντων υδρόλυσης στο cPET με την LCC (1,43 mM και 1,9 mM αντίστοιχα), ενώ αξιόλογη δράση είχε και στα δύο καινοτόμα υλικά oPET και rPET, προκαλώντας στο τελευταίο τη μεγαλύτερη μείωση μάζας σε σχέση με τα υπόλοιπα ένζυμα (Δm=26,6%).	el
heal.abstract	The excessive use of plastic materials has led to important environmental issues due to their disability to biodegrade and the accumulation of their waste. The conventional utilization methods display many drawbacks and for this reason numerous and more environmentally friendly efforts in order to prevent plastic pollution are made. For this purpose, plenty of enzymes with the ability to degrade polymeric materials are being studied. Thus, the aim of this Thesis is the complete biochemical characterization of enzymes capable of degrading plastic materials and the research of their effect on them. Therefore, the effect of six enzymes is studied. Two of them (DmEst and Se1JFR) are discovered using bioinformatics tools, while the remaining four (LCC, PETase, PHOase and PUase) are obtained bibliographically, since especially LCC and PETase are well-studied hydrolases of polyethylene terephthalate and are used as reference enzymes. The polymeric materials in which the enzymes were imposed were polyesters, so they had ester bonds in their structure and consequently the hydrolysis of this bonds by the enzymes was studied. In particular, the plastics that were used, were polycaprolactone (PCL), polyurethane (PU), polylactic acid (PLA), polyhydroxybutyrate (PHB), polybutylene succinate (PBS) and polyethylene terephthalate (PET). The genes of the studied enzymes were initially inserted into the plasmid vectors pET22b(+) and pET-26b(+), followed by their heterologous expression in competent bacterial cells Escherichia coli BL21 (DE3) based on optimized expression models. The next step was the biochemical characterization of the enzymes using as substrate pNPB. The enzyme DmEst had optimum pH=6.0 and optimum T=50 ˚C, it appeared to be generally stable in medium and slightly alkaline pH (7.0-9.0) and in a temperature range 20-50 ˚C, while it showed higher specificity with the substrate pNPB (MichaelisMenten kinetic constants umax = 59.9 Units/mgprot and Km = 0.1938 mM). The enzyme LCC had optimum pH=8.5 and optimum T=60 ˚C, while it was fairly stable within the range pH=5.0-10.0 and Τ=20-80 ˚C. The enzyme Se1JFR had optimum activity at pH=7.0 and T=35 ˚C, it remained stable mostly in medium and alkaline pH (7.0-10.0) and in a temperature range 20-30 ˚C and it had higher specificity with the substrate pNPD. Regarding the enzyme PETase, its optimal operating conditions were pH=7.0 and T=35 ˚C, was more stable in alkaline pH values (8.0-10.0) and temperature values 20-30 ˚C and showed higher specificity with the substrate pNPA. The enzyme PHOase had optimum pH=6.0 and optimum T=40 ˚C, remained stable within the range pH=5.0-10.0 and in a temperature range 20-40 ˚C and had higher specificity with the substrate pNPA. Finally, the enzyme PUase had optimum activity at pH=6.0 and T=40 ˚C, remained stable in medium pH (6.0-8.0) and in a temperature range 20-40 ˚C and had higher specificity with the substrate pNPB. Then, the reactions between enzymes and polyester plastics were conducted, resulting in the conclusion that all enzymes showed degradation evidences. The reactions were carried out at pH=7.0 and Τ=50 ˚C for enzymes DmEst and LCC, at pH=7.0 and Τ=30 ˚C for enzymes Se1JFR and PETase, and at pH=6.0 and Τ=40 ˚C for enzymes PHOase vii and PUase, while all reactions’ buffers were phosphate-phosphate 0.1 M. The duration of the reactions was 3 days (except for PCL for which it was 1 day) and the enzymes’ concentration in the reactions was 13 uΜ. Regarding the polyester plastics, except for PET, the results were studied by the mass reduction of the material, although as regards PET besides the mass reduction, the concentration of released hydrolysis products was studied as well. The conclusion drawn was that in all materials apart from PET, the enzyme LCC had superior action than the rest of the enzymes, with only exception of PU, for which the best result was observed by Se1JFR. However, the rest of the enzymes showed hydrolytic activity in the plastics that were studied too and so they can be characterized as polyesterases. Regarding PET, the most noteworthy conclusions reached are the mass reduction induced by the enzyme Se1JFR in the crystalline powder, which is comparable with the one induced by the well-known PET-hydrolase, PETase (Δm=1.3% against Δm=2.3% for PETase). Moreover, the effect of DmEst in the material is also adequate, since it caused similar concentration of released hydrolysis products in cPET as LCC (1.43 mM and 1.9 mM respectively), while it displayed noteworthy action in the two innovative materials oPET and rPET, inducing in the later the biggest mass reduction compared to the other enzymes (Δm=26.6%).	en
heal.advisorName	Τόπακας, Ευάγγελος	el
heal.committeeMemberName	Βουγιούκα, Σταματίνα	el
heal.committeeMemberName	Κορδάτος, Κωνσταντίνος	el
heal.committeeMemberName	Τόπακας, Ευάγγελος	el
heal.academicPublisher	Εθνικό Μετσόβιο Πολυτεχνείο. Σχολή Χημικών Μηχανικών. Τομέας Σύνθεσης και Ανάπτυξης Βιομηχανικών Διαδικασιών (IV)	el
heal.academicPublisherID	ntua
heal.numberOfPages	147 σ.	el
heal.fullTextAvailability	false