Ετερόλογη έκφραση και βιοχημικός χαρακτηρισμός της ακετυλεστεράσης AsCE20A της νέας οικογένειας CE20 προερχόμενη από τον μικροοργανισμό Arachidicoccus soli

Βάσσος, Ηλίας; Vassos, Ilias

dc.contributor.author	Βάσσος, Ηλίας	el
dc.contributor.author	Vassos, Ilias	en
dc.date.accessioned	2023-01-27T08:14:26Z
dc.date.available	2023-01-27T08:14:26Z
dc.identifier.uri	https://dspace.lib.ntua.gr/xmlui/handle/123456789/56964
dc.identifier.uri	http://dx.doi.org/10.26240/heal.ntua.24662
dc.rights	Default License
dc.subject	Βιοαποικοδόμηση	el
dc.subject	Ακετυλεστεράση	el
dc.subject	Φυλογενετικό δέντρο	el
dc.subject	Ετερόλογη έκφραση	el
dc.subject	Βιοχημικός χαρακτηρισμός	el
dc.subject	Βiochemical characterization	en
dc.subject	Εxpression	en
dc.subject	Ηeterologous	en
dc.subject	Ηylogenetic tree	en
dc.subject	AsCE20A	en
dc.subject	acetyl esterase	en
dc.subject	Biodegradation	en
dc.title	Ετερόλογη έκφραση και βιοχημικός χαρακτηρισμός της ακετυλεστεράσης AsCE20A της νέας οικογένειας CE20 προερχόμενη από τον μικροοργανισμό Arachidicoccus soli	el
heal.type	bachelorThesis
heal.classification	Βιοχημική Μηχανική	el
heal.language	el
heal.access	free
heal.recordProvider	ntua	el
heal.publicationDate	2022-09-27
heal.abstract	Στόχος της παρούσης ερευνητικής μελέτης είναι η ετερόλογη έκφραση και ο βιοχημικός χαρακτηρισμός ενός νέου ενζύμου με την ικανότητα απακετυλίωσης κατάλληλα υποκατεστημένων μονοσακχαριτών σε πολυσακχαριτικές αλυσίδες ξυλόζης. Πιο συγκεκριμένα, το ένζυμο καλείται «ακετυλεστεράση» και εικάζεται ότι ανήκει στην οικογένεια CE20 των Υδατανθρακικών Εστερασών σύμφωνα με την κατάταξη της βάσης δεδομένων CAZy. Το ένζυμο το οποίο μελετήθηκε εντοπίστηκε βιβλιογραφικά ως μέρος ενός συνόλου καταβολισμού τέτοιων δομών από τον μικροοργανισμό Arachidicoccus soli, εξ’ ου και η κωδική του ονομασία AsCE20A. Η μελέτη στράφηκε προς το συγκεκριμένο ένζυμο καθώς προέρχεται από οργανισμό χερσαίου εδάφους και θεωρήθηκε ότι θα έχει μεγαλύτερη συμβατότητα με τον ξενιστή ετερόλογης έκφρασης E. coli, κάτι που όντως παρατηρήθηκε. Για την καλύτερη απεικόνιση της εξελικτικής απόστασης που παρουσιάζει το ένζυμο AsCE20A με αυτό που εξεταζόταν προηγουμένως (ακετυλεστεράση προερχόμενη από τον θαλάσσιο μικροοργανισμό Arenibacter Algicola TG. 406) δημιουργήθηκε ένα φυλογενετικό δέντρο το οποίο περιέχει αυτές τις δύο πρωτεΐνες καθώς και πληθώρα άλλων με παρόμοιες δράσεις, προερχόμενες από κοντινούς μικροοργανισμούς. Σε πρώτο στάδιο, το συνθετικό γονίδιο της ακετυλεστεράσης εισάχθηκε σε δύο διαφορετικούς πλασμιδιακούς φορείς (pET 26 – b (+) και pET 28 – a (+)). Έπειτα, έγινε ανασυνδυασμός επιδεκτικών κυττάρων E. coli BL 21 (DE3) μέσω θερμικού σοκ και ετερόλογη έκφραση σε συνθήκες υγρής καλλιέργειας η οποία έγινε με τη χρήση συγκεκριμένου πρωτοκόλλου του οποίου οι παράμετροι μεταβλήθηκαν κατάλληλα στις περιπτώσεις που κρίθηκε απαραίτητο. Τελικά, εκφράστηκε με επιτυχία και από τους δύο φορείς και απομονώθηκε επαρκής ποσότητα του ενζύμου ώστε να καλύψει τις ανάγκες των επακόλουθων πειραμάτων. Η καλύτερη παραγωγικότητα προήλθε από τον φορέα pET 26 – b (+) με τιμή 1.15 g ενζύμου ανά L καλλιέργειας (έναντι 1.04 από τον φορέα pET 28 – a (+)) όμως, αξιοσημείωτο είναι ότι, η παραγμένη πρωτεΐνη από τον φορέα pET 28 – a (+) επέδειξε μεγαλύτερη δράση. Το θεωρητικό βάρος των δύο συνθετικών πρωτεϊνών υπολογιζόταν λίγο μεγαλύτερο των 70 KDa, γεγονός το οποίο επιβεβαιώθηκε μέσω της δοκιμής με ηλεκτροφόρηση σε πηκτή πολυακρυλαμιδίου. Ακολούθησε ο προσδιορισμός των βέλτιστων συνθηκών δράσης καθώς και της σταθερότητας του ενζύμου. Έπειτα από τις κατάλληλες δοκιμές σε μεγάλα εύρη θερμοκρασίας και pH (20 - 100ᵒC και 3.5 – 10.5 αντίστοιχα), προέκυψε ότι οι βέλτιστες συνθήκες λειτουργίας του ενζύμου είναι η θερμοκρασία των 65 ᵒC και η τιμή pH στο 7. Επίσης, το ένζυμο επέδειξε αξιοσημείωτο βαθμό ανθεκτικότητας σε συνθήκες υψηλής θερμοκρασίας t1/2(70OC≅72 h) αλλά και σχετική ενεργότητα άνω του 75% έπειτα από παραμονή σε διάλυμα με pH = 7.5 για το ίδιο χρονικό διάστημα. (Οι αναφερόμενες τιμές είναι ενδεικτικές και αναγράφονται λόγω της εγγύτητάς τους στα προσδιορισμένα βέλτιστα σημεία). Στη συνέχεια, πραγματοποιήθηκαν αντιδράσεις σε τεχνητό υπόστρωμα το οποίο προσομοιάζει τον φυσικό στόχο του ενζύμου (ακετυλιωμένοι ξυλο – ολιγοσακχαρίτες) και παρατηρήθηκε απελευθέρωση οξικού οξέος (του προϊόντος της απακετυλίωσής τους). Τα αποτελέσματα συγκρίθηκαν με τη δράση μιας εμπορικής ακετυλεστεράσης της οικογένειας CE6 με στόχο την εξακρίβωση της φυσικής δράσης.	el
heal.abstract	The goal of this research paper is the heterologous expression and biochemical characterization of a novel enzyme with the ability of deacetylating respectively substituted monosaccharides in xylose polysaccharide chains. More specifically, the enzyme is called an “acetyl – esterase” and is theorized to be a member of the CE20 family of Carbohydrate Esterases according to the classification of CAZy database. The enzyme which was studied had been spotted bibliographically as a part of an enzyme group responsible for catabolizing such structures originating from the microorganism Arachidicoccus soli which is the reason for its codename AsCE20A. This study turned towards this specific enzyme due to its originating from terrestrial soil and, thus, being more compatible with the microorganism – host of the heterologous expression process E. coli, something that was indeed observed. In an attempt of better visualizing the evolutionary distance between the AsCE20A enzyme and the one previously studied by the Biochemistry Lab (which is an acetyl – esterase originating from the marine microorganism Arenibacter Algicola TG. 406) a phylogenetic tree was created which contained these two proteins as well as an abundance of others with similar action originating from similar microorganisms. At first, the synthetic gene from the acetyl esterase AsCE20A was inserted in two different plasmid vectors (pET 26 – b (+) and pET 28 – a (+)). Then, a recombination protocol of competent E. coli BL 21 (DE3) cells using a thermal shock was applied before the heterologous expression of the recombinant gene in a liquid growth medium. In the cases that was deemed necessary, an optimization process was applied by changing some parameters’ values such as the inducer’s concentration. As it turned out, both vectors were successfully expressed and purified enzymatic solution was retrieved from both, in sufficient quantity to cover all the necessary experiments that followed. The plasmid vector pET 26 – b (+) had the biggest productivity value with 1.15 grams of enzyme per Litre of culture (against 1.04 from the pET 28 – a (+) vector). However, the heterologous protein produced via the latter turned out to be more active. The theoretical molecular weight of both synthetic proteins was slightly over 70 KDa, a value which was confirmed through the polyacrylamide gel electroporation process. The next step was the determination of conditions under which the enzyme performed the best as well as its stability depending on varying temperature and pH values. After the appropriate tests in wide ranges of temperature and pH values (20 - 100ᵒC and 3.5 – 10.5 accordingly), it was identified that the best conditions of enzymatic activity were a temperature of 65 ᵒC and a pH value of 7. Additionally, not only did the enzyme show a noteworthy degree of stability in high temperature conditions (𝑡1/2(70𝑂𝐶) ≅ 72 ℎ) but also, its relative activity after the same timeframe in a buffer solution of pH = 7.5, remained at a level greater than 75%. (The afore x mentioned values are indicative and are stated due to their proximity to the determined conditions of the best enzymatic activity). Moreover, a test of the produced enzyme on a synthetic substrate that resembles the natural target of the enzyme (acetylated xylo – oligosaccharides) and release of Acetic Acid (which is the product of de-acetylation) was observed. The results were compared with the action of a commercially available acetyl esterase of the CE6 family as a means of verifying the action of the heterologous enzyme on such a substrate.	en
heal.advisorName	Τόπακας, Ευάγγελος	el
heal.committeeMemberName	Τόπακας, Ευάγγελος	el
heal.committeeMemberName	Μαμμά, Διομή	el
heal.committeeMemberName	Μπέλτσιος, Κωνσταντίνος	el
heal.academicPublisher	Εθνικό Μετσόβιο Πολυτεχνείο. Σχολή Χημικών Μηχανικών. Τομέας Σύνθεσης και Ανάπτυξης Βιομηχανικών Διαδικασιών (IV). Εργαστήριο Βιοτεχνολογίας	el
heal.academicPublisherID	ntua
heal.numberOfPages	117 σ.	el
heal.fullTextAvailability	false