Παραγωγή, απομόνωση και βιοχημικός χαρακτηρισμός ενζύμου με δυνατότητα βιοεξυγίανσης χλωριωμένων αρωματικών ρύπων

Παντελάκης, Οδυσσεύς-Ιωάννης; Pantelakis, Odyssefs-Ioannis

dc.contributor.author	Παντελάκης, Οδυσσεύς-Ιωάννης	el
dc.contributor.author	Pantelakis, Odyssefs-Ioannis	en
dc.date.accessioned	2023-02-01T11:09:26Z
dc.date.available	2023-02-01T11:09:26Z
dc.identifier.uri	https://dspace.lib.ntua.gr/xmlui/handle/123456789/57008
dc.identifier.uri	http://dx.doi.org/10.26240/heal.ntua.24706
dc.rights	Αναφορά Δημιουργού-Μη Εμπορική Χρήση-Όχι Παράγωγα Έργα 3.0 Ελλάδα	*
dc.rights.uri	http://creativecommons.org/licenses/by-nc-nd/3.0/gr/	*
dc.subject	Εετερόλογη έκφραση	el
dc.subject	Ένζυμα	el
dc.subject	Βιοεξυγίανση	el
dc.subject	Βιοτεχνολογία	el
dc.subject	Αρωματικοί ρύποι	el
dc.subject	Recombinant expression	en
dc.subject	Enzymes	el
dc.subject	Bioremediation	el
dc.subject	Biotechnology	el
dc.subject	Aromatic pollutants	el
dc.title	Παραγωγή, απομόνωση και βιοχημικός χαρακτηρισμός ενζύμου με δυνατότητα βιοεξυγίανσης χλωριωμένων αρωματικών ρύπων	el
dc.title	Recombinant expression, isolation and biochemical characterization of an enzyme with the potential to bioremediate chlorinated aromatic pollutants	en
heal.type	bachelorThesis
heal.classification	Βιοτεχνολογία	el
heal.classification	Χημική Μηχανική	el
heal.classification	Biotechnology	en
heal.classification	Chemical engineering	el
heal.language	el
heal.access	free
heal.recordProvider	ntua	el
heal.publicationDate	2022-10-03
heal.abstract	Ο θετικός αντίκτυπος της εφαρμογής των αρχών της βιοεξυγίανσης για την καταπολέμηση της περιβαλλοντικής ρύπανσης και συγκεκριμένα της απομάκρυνσης των χημικών ειδών που υπάγονται στους επίμονους περιβαλλοντικούς ρύπους (Persistent Organic Pollutants, POPs) είναι καθοριστικής σημασίας. Η συνεχής πρόοδος και η αυξανόμενη ένταξη των βιοκαταλυτών σε προτεινόμενες λύσεις σύγχρονων περιβαλλοντικών ζητημάτων, επιβεβαιώνει την θέση τους ως πράσινες, πιο οικονομικές και ευρείας αποδοχής εναλλακτικές ως προς τις κοινές μεθόδους προσέγγισης. Υπό αυτό το πρίσμα, σκοπό αυτής της διπλωματικής αποτελεί η ετερόλογη έκφραση και βιοχημική μελέτη ενός καινοτόμου ενζύμου, το οποίο απομονώθηκε από τον ασκομύκητα Cladosporium sp. TM138-S3 και έχει επιδείξει ισχυρή ικανότητα διάσπασης ενός πολυχλωριωμένου διφαινυλίου (PCB-29, 2,4,5-τριχλωροδιφαινύλιο), το οποίο ανήκει στην προαναφερθείσα κρίσιμη κατηγορία των επιζήμιων επίμονων οργανικών ρύπων. Πιο συγκεκριμένα, η ετερόλογη έκφραση ξεκινά με τον ανασυνδυασμό μέσω ηλεκτροδιάτρησης, του πλασμιδιακού φορέα pPICZα C που φέρει το γονίδιο-στόχο, σε κύτταρα του ζυμομύκητα Pichia pastoris (κύτταρα wildtype X33). Ακολούθως, πραγματοποιούνται διαδοχικές δοκιμές βελτιστοποίησης του πρωτοκόλλου παραγωγής της ετερόλογης πρωτεΐνης Cladosporium sp. Catalase Phenol Oxidase (ClCPO). Οι συνθήκες που εξετάστηκαν είναι η θερμοκρασία, το θρεπτικό υλικό, η διάρκεια της καλλιέργειας, η προσθήκη μεταλλικών ιχνοστοιχείων και η προσθήκη πρόδρομου μορίου του πρωτεϊνικού συμπαράγοντα. Το πρωτόκολλο που προέκυψε ως βέλτιστο, επιλέχθηκε λαμβάνοντας υπ’ όψιν την τελική παραλαμβανόμενη ποσότητα πρωτεΐνης και την ενεργότητα αυτής, με αρνητικό έλεγχο τα μη ανασυνδυασμένα κύτταρα Χ33. Ακολούθως, εξετάστηκε η αποδοτικότητα απομόνωσης της ετερόλογης πρωτεΐνης με χρωματογραφία συγγένειας μετάλλου, ενώ ελήφθησαν φασματοφωτομετρικά δεδομένα για τα δείγματα που προκύπτουν και για το καθαρό και συμπυκνωμένο ζητούμενο ένζυμο. Εξ αυτών προέκυψαν ενδείξεις που συμφωνούν με τα πορίσματα της βιοπληροφορικής μελέτης ομολογίας και πρόβλεψης της δομής της πρωτεΐνης, ως μία τυπική καταλάση αίμης τύπου b, ενώ μέσω διεξαγωγής πειραμάτων ενεργότητας καταλάσης και φαινολοξειδάσης, επιβεβαιώνεται η διττή ενζυμική ενεργότητα. Εν συνεχεία, πραγματοποιήθηκε ενζυμική απογλυκοζυλίωση τύπου-Ν και συνεπακόλουθη ανάλυση ηλεκτροφόρησης πρωτεΐνης σε πηκτή πολυακρυλαμίδης υπό αποδιατακτικές συνθήκες, πειράματα τα οποία υποδεικνύουν παράλληλα τον υψηλό βαθμό μεταμεταφραστικής γλυκοζυλίωσης από το σύστημα ξενιστή (δυσκολία διαπέρασης πηκτής και κατάληξη σε αυξημένο μοριακό βάρος για το μη απογλυκοζυλιωμένο ένζυμο), όσο και την ταυτότητα του ενζύμου (υψηλή ταύτιση πειραματικού μοριακού βάρους (65 kDa) και θεωρητικού μοριακού βάρους (62,15 kDa)). Τέλος, εξετάστηκε το βέλτιστο εύρος pH για την ενεργότητα καταλάσης του ετερόλογου ενζύμου και βρέθηκε μεταξύ των τιμών 6,0 και 8,0 με μέση μέγιστη ειδική ενεργότητα ίση με 30000 U/mg πρωτεΐνης. Η ολοκλήρωση του βιοχημικού χαρακτηρισμού του ενζύμου ClCPO και η ποσοτικοποίηση της επίδρασης του επί του ρύπου PCB-29 αποτελούν την άμεση συνέχεια των πειραματικών προσπαθειών της παρούσας εργασίας, ενώ ο απώτερος σκοπός του εγχειρήματος είναι η παραγωγή και απομόνωση της πρωτεΐνης σε μεγάλη κλίμακα για αξιοποίησή της σε βιομηχανική ή περιβαλλοντική εφαρμογή βιοεξυγίανσης.	el
heal.abstract	The positive impact of the introduction of the basic principles of bioremediation in the struggle against environmental pollution and specifically in the efforts to reduce the levels of certain chemical species belonging to the category of persistent organic pollutants (POPs) is of crucial importance. The constant progress and increasing integration of biocatalysts into proposed solutions for modern environmental issues, reassures their status as ‘greener’, more economic, and generally accepted alternatives to the conventional methods. In that light, the purpose of this diploma thesis is the recombinant expression and biochemical characterization of a novel enzyme, isolated from the Ascomycetes Cladosporium sp. TM138-S3, that has shown high potential for polychlorinated biphenyl PCB-29 (2,4,5-trichlorodiphenyl) removal, belonging to the -above mentioned- critical category of dangerous persistent organic pollutants. The recombinant expression study begins with the transformation, through electroporation, of wildtype X33 Pichia pastoris yeast cells with the plasmid vector pPICZα C containing the target gene. The next step is the optimization of the expression conditions of the recombinant protein Cladosporium sp. Catalase Phenol Oxidase (ClCPO). The conditions tested here were: cultivation temperature, culture medium, culture duration, addition of trace elements and protein cofactor precursor. The optimized protocol was chosen after taking into consideration the total protein yield and enzymatic activity, in comparison to the negative control of non-recombinant wild type P. pastoris X33 cells grown under the same conditions. Following, the recombinant protein was purified by immobilized metal affinity chromatography and UV/Visible spectra of the purified protein samples and of the concentrated enzyme were recorded. Spectral results and bioinformatics analyses on sequence homology and structure prediction indicate a high similarity of the recombinant protein to a typical heme b catalase, while tests on catalase and phenol oxidase activity were conducted, thus confirming the enzymatic bifunctionality. Subsequently, samples of interest were subjected to enzymatic N-type deglycosylation followed by SDS - Polyacrylamide Gel Electrophoresis analysis, indicating high levels of posttranslational glycosylation by the host (very low mobility in the gel and increased molecular weight for the non-deglycosylated enzyme) and the enzyme identity (agreement of the theoretical (62,15 kDa) and experimental molecular weights (65 kDa)). Finally, the recombinant enzyme was tested for catalase activity and the best pH range was found to be between 6,0 and 8,0 with a mean maximum specific activity of 30000 U/mg protein. The completion of the biochemical characterization of the enzyme ClCPO and the quantification of its effect on the pollutant PCB-29 constitute the next steps of the efforts presented in this diploma thesis, while the ultimate goal of the project is the large-scale production and isolation of the protein, aiming in its utilization in remediation attempts of an industrial or environmental prospect.	en
heal.advisorName	Τόπακας, Ευάγγελος	el
heal.advisorName	Topakas, Evaggelos	en
heal.committeeMemberName	Μαμμά, Διομή	el
heal.committeeMemberName	Μαγουλάς, Κωνσταντίνος	el
heal.academicPublisher	Εθνικό Μετσόβιο Πολυτεχνείο. Σχολή Χημικών Μηχανικών. Τομέας Σύνθεσης και Ανάπτυξης Βιομηχανικών Διαδικασιών (IV). Εργαστήριο Βιοτεχνολογίας	el
heal.academicPublisherID	ntua
heal.numberOfPages	104 σ.	el
heal.fullTextAvailability	false