Xρήση μεθόδων μοριακής εξέλιξης για την ανακάλυψη εν δυνάμει θεραπευτικών ενώσεων κατά ασθενειών που σχετίζονται με την προβληματική αναδίπλωση πρωτεϊνών

Δεληβοριά, Δάφνη-Χρυσάνθη; Delivoria, Dafni Chrysanthi

dc.contributor.author	Δεληβοριά, Δάφνη-Χρυσάνθη	el
dc.contributor.author	Delivoria, Dafni Chrysanthi	en
dc.date.accessioned	2023-06-19T07:22:33Z
dc.identifier.uri	https://dspace.lib.ntua.gr/xmlui/handle/123456789/57841
dc.identifier.uri	http://dx.doi.org/10.26240/heal.ntua.25538
dc.rights	Default License
dc.subject	Protein misfolding diseases	en
dc.subject	Ασθένειες προβληματικής αναδίπλωσης πρωτεϊνών	el
dc.subject	Κυκλικά πεπτίδια	el
dc.subject	Cyclic peptides	en
dc.subject	Protein aggregation	en
dc.subject	High-throughput screening	en
dc.subject	Πρωτεϊνική συσσωμάτωση	el
dc.subject	Μοριακή εξέλιξη	el
dc.subject	Μolecular evolution	en
dc.subject	Διαλογή υψηλής απόδοσης	el
dc.title	Xρήση μεθόδων μοριακής εξέλιξης για την ανακάλυψη εν δυνάμει θεραπευτικών ενώσεων κατά ασθενειών που σχετίζονται με την προβληματική αναδίπλωση πρωτεϊνών	el
dc.title	Molecular evolution of potentially therapeutic compounds against protein misfolding diseases	en
dc.contributor.department	Σύνθεσης και ανάπτυξης βιομηχανικών διαδικασιών	el
heal.type	doctoralThesis
heal.classification	Biochemical engineering	en
heal.classification	Biotechnology	en
heal.classification	Βιοτεχνολογία	el
heal.classification	Βιοχημική μηχανική	el
heal.classification	Χημική μηχανική	el
heal.classification	Chemical engineering	en
heal.dateAvailable	2024-06-18T21:00:00Z
heal.language	en
heal.access	embargo
heal.recordProvider	ntua	el
heal.publicationDate	2019-04-15
heal.abstract	Η προβληματική αναδίπλωση πρωτεϊνών και η επικείμενη συσσωμάτωσή τους αποτελεί κοινό μοριακό χαρακτηριστικό μιας πληθώρας ανθρώπινων ασθενειών που ονομάζονται ασθένειες προβληματικής αναδίπλωσης πρωτεϊνών (protein misfolding diseases, PMDs). Στις PMDs περιλαμβάνονται ασθένειες με ποικίλες παθολογίες και συμπτώματα, όπως η νόσος Alzheimer, η νόσος Parkinson, η κυστική ίνωση και ο καρκίνος. Ανεξάρτητα με την παθογένεσή τους, η συντριπτική πλειοψηφία των PMDs είναι επί της παρούσης ανίατη και επιβάλλει ένα τεράστιο κοινωνικο-οικονομικό αντίκτυπο στην ανθρωπότητα. Συνεπώς, η ανακάλυψη μορίων με την ικανότητα να επιδιορθώνουν την αναδίπλωσή των προβληματικών αυτών πρωτεϊνών αποτελεί μία ευοίωνη προσέγγιση για την ανάπτυξη νέων φαρμάκων κατά των PMDs. Για το σκοπό αυτό, στην παρούσα διδακτορική διατριβή αναφέρεται η ανάπτυξη μίας καινοτόμου βακτηριακής πλατφόρμας για την ανάκάλυψη εν δυνάμει θεραπευτικών ενώσεων κατά ενός ευρέος φάσματος PMDs. Σε αυτό το σύστημα, βακτηριακά κύτταρα Escherichia coli τροποποιήθηκαν γενετικά ώστε να εκτελούν δύο ταυτόχρονες διεργασίες: (i) να παράγουν συνδυαστικές βιβλιοθήκες με πάνω από 200 εκατομμύρια διαφορετικά κυκλικά ολιγοπεπτίδια και (ii) να επιτρέπουν την ταυτοποίηση των βιοδραστικών ενώσεων με την ικανότητα να επιδιορθώνουν την προβληματική αναδίπλωση των πρωτεϊνών-στόχων ή/και να αναστέλλουν την παθολογική συσσωμάτωσή τους, χρησιμοποιώντας ένα απλό σύστημα γενετικής επιλογής. Το σύστημα αυτό στηρίζεται στη σύνδεση της προβληματικής αναδίπλωσης της πρωτεΐνης-στόχου με την εμφάνιση ενός φθορίζοντα φαινότυπου, με αποτέλεσμα να επιτρέπεται ο εντοπισμός και η απομόνωση των βιοδραστικών ενώσεων χρησιμοποιώντας κυτταρομετρία ροής υψηλής απόδοσης. Με τον τρόπο αυτό, μειώνεται σημαντικά ο χρόνος καθώς και το κόστος της ανακάλυψης πιθανών θεραπευτικών ενώσεων κατά των PMDs. Η εν λόγω μεθοδολογία χρησιμοποιήθηκε κατά τεσσάρων μη-συναφών πρωτεϊνικών στόχων: (i) μίας καρκινογόνου παραλλαγής της ανθρώπινης ογκοκατασταλτικής πρωτεΐνης p53 που περιέχει την αντικατάσταση της τυροσίνης στη θέση 220 από κυστεΐνη (p53(Y220C)), (ii) του αμυλοειδούς β πεπτιδίου (Αβ42) που έχει συσχετισθεί ευρέως με τη νόσο Alzheimer, (iii) μίας μεταλλαγμένης μορφής της δισμουτάσης του υπεροξειδίου 1 που περιέχει την αντικατάσταση της αλανίνης στη θέση 4 από βαλίνη (SOD1(A4V)) και η οποία έχει συσχετισθεί με δριμύτατες μορφές της νόσου του κινητικού νευρώνα και (iv) με μία παθογόνα μορφή της πρωτεΐνης huntingtin που περιέχει 97 κατάλοιπα γλουταμίνης (ΗΤΤ-97Q), και η οποία έχει συσχετισθεί με την νόσο του Huntington. Χρησιμοποιώντας το εν λόγω σύστημα ήταν δυνατή η απομόνωση τεσσάρων διακριτών βακτηριακών πληθυσμών που παράγουν κυκλικά πεπτίδια με την ικανότητα να επιδιορθώνουν την προβληματική αναδίπλωση ή/και να αναστέλλουν την παθολογική συσσωμάτωσή των πρωτεϊνών-στόχων. Τα επιλεγμένα κυκλικά πεπτίδια κατά της p53(Y220C) και της Αβ42 εξετάστηκαν περαιτέρω in vitro και in vivo με σκοπό την επιβεβαίωση της βιοδραστικότητάς τους. Συγκεκριμένα, στην περίπτωση της p53(Y220C), εφαρμογή της παραπάνω βιοτεχνολογικής μεθοδολογίας οδήγησε στην ανακάλυψη έξι ενώσεων με πιθανή βιοδραστικότητα. Οι ενώσεις αυτές εξετάστηκαν περαιτέρω ως προς την ικανότητά τους να αυξάνουν τη θερμοδυναμική σταθερότητα της πρωτεΐνης-στόχου, να αναστέλλουν τη συσσωμάτωσή της και να αποκαθιστούν τη φυσιολογική λειτουργίας της σε μία καρκινική σειρά ανθρώπινου μελανώματος που φέρει την Y220C μετάλλαξη. Στην πλειοψηφίας τους, οι επιλεγμένες ενώσεις βρέθηκαν ικανές να επιβραδύνουν τον ανεξέλεγκτο πολλαπλασιασμό των καρκινικών κυττάρων, με μία εξ’ αυτών να παρουσιάζει αξιόλογη αντικαρκινική επίδραση. Επιπλέον, η ένωση αυτή βρέθηκε να αυξάνει σημαντικά τη θερμοδυναμική σταθερότητα της p53(Y220C) μεταλλαγής, ενώ δύο εκ των υπόλοιπων ενώσεων βρέθηκαν ικανές να αναστέλλουν τη συσσωμάτωση της πρωτεΐνης, χωρίς να επηρεάζουν τη θερμοδυναμική της σταθερότητα. Τα αποτελέσματα αυτά υποδηλώνουν ότι το βακτηριακό σύστημα επιτρέπει την ανακάλυψη εν δυνάμει θεραπευτικών ενώσεων κατά της p53(Y220C) μεταλλαγής με πιθανή δράση μέσω διαφορετικών μοριακών μηχανισμών. Στην περίπτωση της Αβ42, η εφαρμογή του βακτηριακού συστήματος επέτρεψε τον εντοπισμό παραπάνω από 400 κυκλικών πεπτιδίων με πιθανή δράση κατά της συσσωμάτωσης της Αβ42, τα οποία ομαδοποιήθηκαν σε 20 διακριτές οικογένειες βάσει της πεπτιδικής τους ακολουθίας. Στη συνέχεια, δύο αντιπροσωπευτικά πεπτίδια των δύο επικρατούντων οικογενειών συντέθηκαν οργανικά και εξετάστηκαν περαιτέρω in vitro και in vivo. Οι μελέτες αυτές ανέδειξαν την ικανότητα και των δύο επιλεγμένων κυκλικών πεπτιδίων να αναστέλλουν τη συσσωμάτωση της Αβ42 με μεγάλη αποτελεσματικότητα. Επίσης, τα δύο πεπτίδια βρέθηκαν να επηρεάζουν σε διαφορετικό βαθμό την πρωτογενή και δευτερογενή πυρηνογένεση της διαδικασίας συσσωμάτωσης, υποδηλώνοντας ότι μόρια από διαφορετικές οικογένειες μπορεί να δρουν μέσω διαφορετικών μηχανισμών. Κατόπιν, οι δύο επιλεγμένες κυκλικές ενώσεις μελετήθηκαν σε διαγονιδιακά στελέχη του νηματώδη σκώληκα Caenorhabditis elegans που λειτουργούν ως μοντέλα της νόσου Alzheimer και βρέθηκαν ικανά να προστατεύουν τα ζώα από την κυτταροτοξική συσσωμάτωση της Αβ42 καθώς οδήγησαν σε μείωση των εναποθέσεων της πρωτεΐνης στα κύτταρα των σκωλήκων, αύξηση της κινητικότητάς τους και μείωση του ρυθμό παράλυσής τους. Τέλος, εφαρμόζοντας αλληλούχιση νέας γενιάς και στοχευμένη μεταλλαξιγένεση επιτεύχθει η γρήγορη ταυτοποίηση των σχέσεων δομής-δραστικότητας των κυκλικών πεπτιδίων και τα απαραίτητα χαρακτηριστικά για μέγιστη δραστικότητα. Συνολικά, η βακτηριακή πλατφόρμα που παρουσιάζεται στην παρούσα εργασία αποτελεί μία ιδιαιτέρως ευπροσάρμοστη τεχνολογία που επιτρέπει την γρήγορη και οικονομική αξιολόγηση παραπάνω από 200 εκατομμυρίων διαφορετικών κυκλικών πεπτιδίων με σκοπό την ανακάλυψη και τον χαρακτηρισμό ενώσεων με την ικανότητα να επιδιορθώνουν την προβληματική αναδίπλωση ή/και την συσσωμάτωση των πρωτεϊνών-στόχων. Εξ’ όσων γνωρίζουμε, το γεγονός αυτό την καθιστά το πρώτο σύστημα σάρωσης μορίων που έχει αναφερθεί μέχρι σήμερα στη βιβλιογραφία, που επιτρέπει την αξιολόγηση ενός πρωτοφανούς αριθμού ενώσεων, με κριτήριο τη λειτουργικότητά τους έναντι της παθογενούς πρωτεϊνικής αναδίπλωσης και το οποίο έχει πιθανή εφαρμογή σε ένα ευρύ φάσμα PMDs.	el
heal.abstract	Protein misfolding and aggregation are defining features of a wide range of human conditions which have been collectively termed protein misfolding diseases (PMDs). These include disorders with diverse pathologies and symptoms, such as Alzheimer’s disease, Parkinson’s disease, cystic fibrosis and cancer. Whichever their pathogenesis however, the vast majority of PMDs remain to date incurable and impose a very high socio-economic burden on humanity. To address this unmet medical need, in this thesis we report the development of a novel integrated bacterial platform for the discovery of potential therapeutics against a wide range of PMDs. In this system, Escherichia coli cells are genetically engineered in order to perform two simultaneous tasks: (i) produce combinatorial libraries of more than 200 million drug-like, head-to-tail cyclic oligopeptides using protein-splicing technology and (ii) enable the identification of the bioactive cyclic peptides that correct the problematic folding and/or inhibit the aggregation of disease-associated misfolding-prone proteins (MisPs) using a genetic assay that links the folding of the target MisP with a fluorescent phenotype. In this way, the bioactive cyclic peptide hits can be identified in an ultrahigh-throughput manner using flow cytometric cell sorting, thus significantly decreasing the overall cost, time and complexity of early drug discovery for PMDs. We utilized the developed platform against four unrelated targets: (i) a carcinogenic variant of the tumour suppressor protein p53, which contains a tyrosine to cysteine substitution at position 220 (p53(Y220C)), (ii) the 42 residue form of the amyloid β peptide (Aβ42), widely associated with Alzheimer’s disease, (iii) the Cu/Zn superoxide dismutase 1 containing an alanine to valine substitution at position 4 (SOD1(A4V)), which is linked with amyotrophic lateral sclerosis and (iv) a pathogenic variant of huntingtin containing a 97-glutamine expansion (HTT-97Q), which is associated with Huntington’s disease. This process resulted in the isolation of four distinct bacterial populations that produce cyclic peptides with the ability to rescue protein misfolding and aggregation of the respective target MisP. The identified hits against p53(Y220C) and Aβ42 were further tested in vitro and in vivo in order to verify their bioactivity. Specifically, using this system, we were able to identify six putative rescuers of p53(Y220C) misfolding, which were further evaluated for their ability to increase the thermodynamic stability of the target protein, inhibit its aggregation and restore its physiological function in mammalian cell lines. The majority of the selected hits were found to affect cancer cell growth, with one of them exhibiting a pronounced anti-cancer effect. Furthermore, in vitro evaluation of the selected hits revealed that the latter cyclic peptide was able to significantly stabilize p53(Y220C), while two other cyclic peptides were able to interfere with the aggregation of p53(Y220C), without affecting its thermodynamic stability. This indicates that the bacterial platform enables the identification of bioactive cyclic peptides that rescue the pathogenic misfolding of p53(Y220C) by different mechanisms. Moreover, using this system we were able to identify more than 400 putative modulators of Aβ42 aggregation, which we divided into 20 distinct clusters sharing similar sequence characteristics. Two representative members of the two most dominant clusters were chemically synthesized and evaluated in vitro and in vivo. Both selected macrocycles were found to potently inhibit the aggregation of Aβ42 in vitro at sub-stoichiometric ratios, by interfering with both the primary and secondary nucleation steps of Aβ42 aggregation, albeit to a different extent. This suggests that members from different clusters may ameliorate the pathogenesis of Aβ42 by diverse inhibitory mechanisms. Furthermore, when tested in two Caenorhabditis elegans models of Alzheimer’s disease both cyclic peptides were able to protect from the Aβ42 aggregation associated cytotoxicity, by decreasing the Aβ42 deposits found in the worms’ body wall muscle cells, increasing their locomotion and delaying their paralysis. Finally, a combination of deep sequencing and site-directed mutagenesis analyses allowed the rapid definition of structure-activity relationships and consensus motifs required for optimal bioactivity among each selected cluster. Overall, the herein described approach represents a highly adaptable ultrahigh-throughput strategy that enables the facile and cost-effective investigation of more than 200 million different molecules and the discovery and characterization of potent rescuers of pathogenic protein misfolding and/or aggregation. To our knowledge, this constitutes the largest functional screen of drug-like molecular entities described to date, with potential applicability against a broad range of PMDs.	en
heal.abstract	Protein misfolding and aggregation are defining features of a wide range of human conditions which have been collectively termed protein misfolding diseases (PMDs). These include disorders with diverse pathologies and symptoms, such as Alzheimer’s disease, Parkinson’s disease, cystic fibrosis and cancer. Whichever their pathogenesis however, the vast majority of PMDs remain to date incurable and impose a very high socio-economic burden on humanity. To address this unmet medical need, in this thesis we report the development of a novel integrated bacterial platform for the discovery of potential therapeutics against a wide range of PMDs. In this system, Escherichia coli cells are genetically engineered in order to perform two simultaneous tasks: (i) produce combinatorial libraries of more than 200 million drug-like, head-to-tail cyclic oligopeptides using protein-splicing technology and (ii) enable the identification of the bioactive cyclic peptides that correct the problematic folding and/or inhibit the aggregation of disease-associated misfolding-prone proteins (MisPs) using a genetic assay that links the folding of the target MisP with a fluorescent phenotype. In this way, the bioactive cyclic peptide hits can be identified in an ultrahigh-throughput manner using flow cytometric cell sorting, thus significantly decreasing the overall cost, time and complexity of early drug discovery for PMDs. We utilized the developed platform against four unrelated targets: (i) a carcinogenic variant of the tumour suppressor protein p53, which contains a tyrosine to cysteine substitution at position 220 (p53(Y220C)), (ii) the 42 residue form of the amyloid β peptide (Aβ42), widely associated with Alzheimer’s disease, (iii) the Cu/Zn superoxide dismutase 1 containing an alanine to valine substitution at position 4 (SOD1(A4V)), which is linked with amyotrophic lateral sclerosis and (iv) a pathogenic variant of huntingtin containing a 97-glutamine expansion (HTT-97Q), which is associated with Huntington’s disease. This process resulted in the isolation of four distinct bacterial populations that produce cyclic peptides with the ability to rescue protein misfolding and aggregation of the respective target MisP. The identified hits against p53(Y220C) and Aβ42 were further tested in vitro and in vivo in order to verify their bioactivity. Specifically, using this system, we were able to identify six putative rescuers of p53(Y220C) misfolding, which were further evaluated for their ability to increase the thermodynamic stability of the target protein, inhibit its aggregation and restore its physiological function in mammalian cell lines. The majority of the selected hits were found to affect cancer cell growth, with one of them exhibiting a pronounced anti-cancer effect. Furthermore, in vitro evaluation of the selected hits revealed that the latter cyclic peptide was able to significantly stabilize p53(Y220C), while two other cyclic peptides were able to interfere with the aggregation of p53(Y220C), without affecting its thermodynamic stability. This indicates that the bacterial platform enables the identification of bioactive cyclic peptides that rescue the pathogenic misfolding of p53(Y220C) by different mechanisms. Moreover, using this system we were able to identify more than 400 putative modulators of Aβ42 aggregation, which we divided into 20 distinct clusters sharing similar sequence characteristics. Two representative members of the two most dominant clusters were chemically synthesized and evaluated in vitro and in vivo. Both selected macrocycles were found to potently inhibit the aggregation of Aβ42 in vitro at sub-stoichiometric ratios, by interfering with both the primary and secondary nucleation steps of Aβ42 aggregation, albeit to a different extent. This suggests that members from different clusters may ameliorate the pathogenesis of Aβ42 by diverse inhibitory mechanisms. Furthermore, when tested in two Caenorhabditis elegans models of Alzheimer’s disease both cyclic peptides were able to protect from the Aβ42 aggregation associated cytotoxicity, by decreasing the Aβ42 deposits found in the worms’ body wall muscle cells, increasing their locomotion and delaying their paralysis. Finally, a combination of deep sequencing and site-directed mutagenesis analyses allowed the rapid definition of structure-activity relationships and consensus motifs required for optimal bioactivity among each selected cluster. Overall, the herein described approach represents a highly adaptable ultrahigh-throughput strategy that enables the facile and cost-effective investigation of more than 200 million different molecules and the discovery and characterization of potent rescuers of pathogenic protein misfolding and/or aggregation. To our knowledge, this constitutes the largest functional screen of drug-like molecular entities described to date, with potential applicability against a broad range of PMDs.	en
heal.sponsor	Financial support was provided by the following projects: (i) STHENOS-b” (MIS 5002398) which is funded by the Operational Programme “Competitiveness, Entrepreneurship and Innovation” (NSRF 2014-2020) and co-financed by Greece and the EU (European Regional Development Fund), (ii) “NEUROTHERAPY” in the framework of the research grant “Aristeia” and (iii) “STHENOS”, the last two financed by the Hellenic General Secretariat of Research and Technology (GSRT) and the National Strategic Reference Framework (NSRF). This work was also supported by a short-term scientific mission Grant from COST Action BM1405.	en
heal.sponsor	Η εργασία υποστηρίχθηκε από τα ακόλουθα έργα: (i) ΣΘΕΝΟΣ-β» (MIS 5002398) που χρηματοδοτείται από το Επιχειρησιακό Πρόγραμμα «Ανταγωνιστικότητα, Επιχειρηματικότητα και Καινοτομία» (ΕΣΠΑ 2014-2020) και συγχρηματοδοτείται από την Ελλάδα και το Ευρωπαϊκό Ταμείο Περιφερειακής Ανάπτυξης, (ii) «NEUROTHERAPY» στο πλαίσιο της δράσης «Αριστεία» και (iii) «ΣΘΕΝΟΣ». Τα δύο τελευταία έργα χρηματοδοτούνται από τη Γενική Γραμματεία Έρευνας και Τεχνολογίας (ΓΓΕΤ) και την Εθνικό Στρατηγικό Πλαίσιο Αναφοράς (ΕΣΠΑ). Τέλος η εργασία υποστηρίχθηκε και από τη δράση COST BM1405.	el
heal.advisorName	Κολίσης, Φραγκίσκος	el
heal.advisorName	Kolisis, Frangiskos	en
heal.committeeMemberName	Κέκος, Δημήτριος	el
heal.committeeMemberName	Σκρέτας, Γεώργιος	el
heal.committeeMemberName	Χατζηνικολάου, Δημήτριος	el
heal.committeeMemberName	Τόπακας, Ευάγγελος	el
heal.committeeMemberName	Ευθυμιόπουλος, Σπύρος	el
heal.committeeMemberName	Kekos, Dimitrios
heal.committeeMemberName	Skretas, Georgios
heal.committeeMemberName	Hatzinikolaou, Dimitris
heal.committeeMemberName	Topakas, Evangelos
heal.committeeMemberName	Efthimiopoulos, Spiros
heal.committeeMemberName	Salvador, Ventura
heal.academicPublisher	Εθνικό Μετσόβιο Πολυτεχνείο. Σχολή Χημικών Μηχανικών	el
heal.academicPublisherID	ntua
heal.numberOfPages	300
heal.fullTextAvailability	false
heal.fullTextAvailability	false
heal.fullTextAvailability	false