Αξιοποίηση λιγνινοκυτταρινούχου βιομάζας για την παραγωγή φρουκτόζης και μονομερών παραγωγών του φουρανίου

Γιαννάκου, Σταυρωτή; Giannakou, Stavroti

dc.contributor.author	Γιαννάκου, Σταυρωτή	el
dc.contributor.author	Giannakou, Stavroti	en
dc.date.accessioned	2023-12-28T10:09:46Z
dc.date.available	2023-12-28T10:09:46Z
dc.identifier.uri	https://dspace.lib.ntua.gr/xmlui/handle/123456789/58486
dc.identifier.uri	http://dx.doi.org/10.26240/heal.ntua.26182
dc.rights	Αναφορά Δημιουργού-Μη Εμπορική Χρήση-Όχι Παράγωγα Έργα 3.0 Ελλάδα	*
dc.rights.uri	http://creativecommons.org/licenses/by-nc-nd/3.0/gr/	*
dc.subject	Προκατεργασίες	el
dc.subject	Λιγνινοκυτταρινούχος βιομάζα	el
dc.subject	Ενζυμική υδρόλυση	el
dc.subject	HMF	en
dc.subject	Φουράνια	el
dc.subject	Οξειδάση της γαλακτόζης	el
dc.subject	Ενζυμική ισομερείωση	el
dc.subject	2,5-φουρανοδικαρβοξυλικό οξύ	el
dc.subject	Οξειδωτικό μονοπάτι	el
dc.title	Αξιοποίηση λιγνινοκυτταρινούχου βιομάζας για την παραγωγή φρουκτόζης και μονομερών παραγωγών του φουρανίου	el
heal.type	bachelorThesis
heal.classification	βιοτεχνολογία	el
heal.language	el
heal.access	free
heal.recordProvider	ntua	el
heal.publicationDate	2023-07-27
heal.abstract	Σκοπός της παρούσας διπλωματικής εργασίας είναι η αξιοποίηση της λιγνινοκυτταρινούχος βιομάζας για την βιοκαταλυτική παραγωγή φρουκτόζης και μονομερών ενώσεων παραγώγων των φουρανίων. Αρχικά, στο πρώτο μέρος μελετήθηκε η προκατεργασία στελεχών αραβοσίτου με τη χρήση μικροκυμάτων και αντιστάσεων σε διαφορετικές θερμοκρασίες και χρόνους, αλλά και διαλύτες. Ακολούθησαν σειρές πειραμάτων ενζυμικής υδρόλυσης της βιομάζας σε μικρή κλίμακα. Στην αρχή μελετήθηκε η προκατεργασία στελεχών αραβοσίτου με τη χρήση μικροκυμάτων και αντιστάσεων σε θερμοκρασία 150℃, με διαλύτη νερό-αιθανόλη σε αναλογία 50:50 και μέτρηση της γλυκόζης στις 24 και 72 h. Επιπλέον, επιχειρήθηκε να προκατεργαστούν στελέχη αραβοσίτου με τη χρήση μικροκυμάτων και αντιστάσεων, με διαλύτη νερό-αιθανόλη σε αναλογία 50:50, σε διαφορετικές θερμοκρασίες και σε διαφορετικούς χρόνους προκατεργασίας. Ακόμη, στην παρούσα εργασία επιχειρήθηκε η προκατεργασία στελεχών αραβοσίτου με αντιστάσεις και μικροκύματα σε διαφορετικούς χρόνους προκατεργασίας και χρόνο προ-επώασης και προσθήκη οξικού οξέος στους διαλύτες, λόγω του ότι δεν ήταν εφικτή η περαιτέρω αύξηση της θερμοκρασίας. Η υψηλότερη απόδοση σε γλυκόζη, 18,7 g/L, επιτυγχάνεται στην προκατεργασία με αντιστάσεις στους 150 ℃ και για χρόνο προκατεργασίας 90 min, χωρίς προ-επώαση και με συγκέντρωση οξικού οξέος 2,5%. Για την προκατεργασία με αντιστάσεις με την αύξηση του χρόνου προκατεργασίας και την προσθήκη οξικού οξέος αυξάνεται η απόδοση σε γλυκόζη, συγκεκριμένα για 1,5 % σημειώνεται η βέλτιστη τιμή, 18,3 g/L. Στη συνέχεια, μελετήθηκε η αποδοτικότητα της ήπιας οξειδωτικής προκατεργασίας λιγνινοκυτταρινούχων υλικών με οργανικούς διαλύτες ως προς τη χρήση διαφορετικών διαλυτών, καταλυτών και διαφορετικών συνθηκών. Γι΄αυτόν τον λόγο πραγματοποιήθηκαν αρχικά πειράματα ενζυμικών υδρολύσεων προκειμένου από την κυτταρίνη των υλικών να παραχθεί γλυκόζη και στη συνέχεια πειράματα ενζυμικών ισομερειώσεων ώστε η παραγόμενη γλυκόζη να μετατραπεί σε φρουκτόζη. Με βάση τα αποτελέσματα αυτών των πειραμάτων συγκρίθηκαν τα προκατεργασμένα υλικά και αξιολογήθηκε η αποδοτικότητα της κάθε προκατεργασίας. Ειδικότερα, μεταξύ των προκατεργασμένων υλικών τα υλικά οξιάς που είχαν προκατεργαστεί με ισοβουτανόλη σε υψηλότερη θερμοκρασία 175 και 160℃ για 120 min παρουσίασαν τις υψηλότερες μετατροπές κυτταρίνης σε γλυκόζη (95,1% και 81,2%, αντίστοιχα) με παραγωγή 70,5 g και 56,6 g φρουκτόζης ανά 100 g προκατεργασμένης βιομάζας, αντίστοιχα. Ακόμα, η προκατεργασία στην υψηλή θερμοκρασία των 175℃ για 120 min με χρήση ισοβουτανόλης σε υλικά από πεύκο, επέφερε και αυτή υψηλή μετατροπή κυτταρίνης σε γλυκόζη (73,1%) και παραγωγή 53,4 g φρουκτόζης ανά 100 g προκατεργασμένης βιομάζας. Επιπλέον, τα υλικά που είχαν προκατεργαστεί με καταλύτες εμφάνισαν μικρότερη απόδοση από αυτά που στην προκατεργασία απουσίαζε καταλύτης. Η βέλτιστη απόδοση στα υλικά με καταλύτη επιτεύχθηκε σε αυτό που είχε προκατεργαστεί με καταλύτη POM, με 54,7% μετατροπή κυτταρίνης σε γλυκόζη και παραγωγή 30,7 g φρουκτόζης ανά 100 g προκατεργασμένης βιομάζας. Στο δεύτερο μέρος της εργασίας, επιλέχθηκε να μελετηθεί για την οξειδωτική της δράση στο HMF η οξειδάση της γαλακτόζης. Η οξειδάση της γαλακτόζης ανήκει στην οικογένεια ΑΑ5 της CAZy βάσης δεδομένων και τυπικά δρα σε γαλακτόζη. Το γονίδιο που εκφράζει την οξειδάση της γαλακτόζης εισήχθη στον ζυμομύκητα Pichia pastoris. Το μετασχηματισμένο στέλεχος P. Pastoris αναπτύχθηκε σε στερεό και στη συνέχεια σε υγρό μέσο. Έπειτα, απομονώθηκε η οξειδάση της γαλακτόζης μέσω φυγοκέντρησης, φιλτραρίσματος με μοριακά φίλτρα υπό κενό και τελικά υπερδιήθησης με χρήση μοριακών φίλτρων. Ακολούθησε χρωματογραφία συγγένειας για την ολοκλήρωση της απομόνωσης του ενζύμου. Προκειμένου να πιστοποιηθεί ότι το ένζυμο που απομονώθηκε ήταν η οξειδάση της γαλακτόζης εφαρμόστηκε η Ηλεκτροφόρηση Πρωτεϊνών σε πήκτωμα Πολυακρυλαμιδίου υπό Αποδιατακτικές Συνθήκες SDS-Page gel και επιβεβαιώθηκε το μοριακό βάρος 68 kDa. Ακολούθως, πραγματοποιήθηκε ο προσδιορισμός του βέλτιστου pH και θερμοκρασίας δράσης του ενζύμου χρησιμοποιώντας ως υπόστρωμα τη γαλακτόζη 50 mM. Συγκεκριμένα, το ένζυμο οξειδάση της γαλακτόζης εμφάνισε βέλτιστη δράση σε pH=6,0 και Τ= 40 ˚C σε ρυθμιστικό διάλυμα φωσφορικών καλίου (Potassium phosphate buffer). Τέλος, πραγματοποιήθηκαν οι αντιδράσεις της οξειδάση της γαλακτόζης με το HMF αλλά και άλλα φουράνια, όπως DFF, HMFCA, FFCA και FDCA. Προέκυψε το συμπέρασμα ότι η οξειδάση της γαλακτόζης μπορεί να οξειδώσει τα φουράνια, αφού εμφάνισε ενεργότητα στο HMF, οξειδώνοντας το μέχρι την παραγωγή του DFF και HMFCA, χωρίς να συνεχίζεται περαιτέρω η αντίδραση προς παραγωγή FDCA.	el
heal.abstract	The purpose of this thesis is the utilization of lignocellulosic biomass for the biocatalytic production of fructose and monomeric compounds of furan derivatives. Initially, in the first part, the pretreatment of corn stover was studied using microwave and resistive heating at different temperatures and times, as well as different solvents. This was followed by enzymatic hydrolysis experiments on a small scale. At the beginning, the pretreatment of corn stover was studied using microwaves and resistors at a temperature of 150℃, with a water-ethanol solvent in a ratio of 50:50 and glucose concentration was measured at 24 and 72 h. Also, it was attempted to pretreat corn stover using microwaves and resistors, with a 50:50 water-ethanol solvent, at different temperatures and at different pre-treatment times. Also, in the present work, the pretreatment of corn stover with resistors and microwaves at different pretreatment times and pre-incubation time and addition of acetic acid to the solvents was attempted, due to the fact that further temperature increase was not possible. The highest glucose yield, 18.7 g/L, is obtained in the pre-treatment with resistors at 150 ℃ and for a pre-treatment time of 90 min, without pre-incubation and with an acetic acid concentration of 2.5%. For pretreatment with resistive heating, an increased pretreatment time and adding acetic acid increases the glucose yield, specifically for 1.5%, with the optimum value being 18.3 g/L. Then, the efficiency of the mild oxidative pretreatment of lignocellulosic materials with organic solvents was studied in terms of the use of different solvents, catalysts and different conditions. For this reason, enzymatic hydrolysis experiments were first carried out in order to produce glucose from the cellulose of the materials, and then enzymatic isomerization experiments so that the produced glucose could be converted into fructose. Based on the results of these experiments, the pretreated materials were compared, and the efficiency of each pretreatment was evaluated. Specifically, among the pretreated materials, the oak materials pretreated with isobutanol at higher temperatures of 175 and 160°C for 120 minutes showed the highest cellulose conversion to glucose (95.1% and 81.2% respectively), with a production of 70.5 g and 56.6 g of fructose per 100 g of pre-processed biomass, respectively. Furthermore, the pretreatment at the high temperature of 175℃ for 120 min using isobutanol in pine materials also resulted in a high conversion of cellulose to glucose (73.1%) and production of 53.4 g of fructose per 100 g of pretreated biomass. Additionally, materials pretreated with catalysts showed lower yields compared to those without a catalyst. The optimum yield in materials with a catalyst was achieved with the POM catalyst, with a 54.7% cellulose conversion to glucose and a production of 30.7 g of fructose per 100 g of pretreated biomass. In the second part of the study, galactose oxidase was chosen to be studied for its oxidative activity in HMF. Galactose oxidase belongs to the AA5 family of the CAZy database and typically acts on galactose. The gene expressing galactose oxidase was introduced into the yeast Pichia pastoris. The transformed P. pastoris strain was grown on a solid and then on liquid medium. Galactose oxidase was then isolated by centrifugation, filtration using molecular filters under vacuum ,and finally molecular filter ultrafiltration. Metal Affinity Chromatography followed to complete the isolation of the enzyme. To confirm that the enzyme isolated was galactose oxidase, Protein Electrophoresis was performed on a SDS-Page gel under denaturing SDS-Page gel conditions and a molecular weight of 68 kDa was confirmed. Subsequently, the determination of the optimal pH and temperature of the enzyme was carried out using 50 mM galactose as a substrate. Specifically, the enzyme galactose oxidase showed optimal activity at pH=6.0 and T= 40 ˚C in potassium phosphate buffer. Finally, the reactions of galactose oxidase with HMF and other furans, such as DFF, HMFCA, FFCA and FDCA, were carried out. It was concluded that galactose oxidase can oxidize furans, since it showed activity on HMF, oxidizing it to the production of DFF and HMFCA, without continuing the reaction further to produce FDCA.	en
heal.advisorName	Ευάγγελος, Τόπακας	el
heal.committeeMemberName	Διομή, Μαμμά	el
heal.committeeMemberName	Χαράλαμπος, Σαρίμβεης	el
heal.academicPublisher	Εθνικό Μετσόβιο Πολυτεχνείο. Σχολή Χημικών Μηχανικών. Τομέας Σύνθεσης και Ανάπτυξης Βιομηχανικών Διαδικασιών (IV)	el
heal.academicPublisherID	ntua
heal.numberOfPages	118 σ.	el
heal.fullTextAvailability	false