Ανακάλυψη και χαρακτηρισμός καινοτόμων οξειδωτικών ενζύμων με δυνατότητα αποπολυμερισμού/τροποποίησης πολυολεφινών

Σοφιανόπουλος, Ιάσων; Sofianopoulos, Iason

dc.contributor.author	Σοφιανόπουλος, Ιάσων	el
dc.contributor.author	Sofianopoulos, Iason	en
dc.date.accessioned	2024-03-12T08:11:39Z
dc.date.available	2024-03-12T08:11:39Z
dc.identifier.uri	https://dspace.lib.ntua.gr/xmlui/handle/123456789/58978
dc.identifier.uri	http://dx.doi.org/10.26240/heal.ntua.26674
dc.rights	Αναφορά Δημιουργού 3.0 Ελλάδα	*
dc.rights.uri	http://creativecommons.org/licenses/by/3.0/gr/	*
dc.subject	Πλαστικά	el
dc.subject	Πολυολεφίνες	el
dc.subject	Ετερόλογη έκφραση	el
dc.subject	Ένζυμα	el
dc.subject	Ενζυμική αποικοδόμηση	el
dc.subject	Plastics	en
dc.subject	Polyolefins	en
dc.subject	Recombinant expression	en
dc.subject	Enzymes	en
dc.subject	Enzymatic degradation	en
dc.title	Ανακάλυψη και χαρακτηρισμός καινοτόμων οξειδωτικών ενζύμων με δυνατότητα αποπολυμερισμού/τροποποίησης πολυολεφινών	el
heal.type	bachelorThesis
heal.classification	Βιοτεχνολογία	el
heal.classification	Χημική Μηχανική	el
heal.classification	Biotechnology	en
heal.classification	Chemical engineering	en
heal.language	el
heal.access	free
heal.recordProvider	ntua	el
heal.publicationDate	2023-09-28
heal.abstract	Πλήθος νέων και επιζήμιων περιβαλλοντικών προβλημάτων έχει ανακύψει από τη διευρυμένη χρήση συνθετικών πολυμερών, των οποίων η ανθεκτικότητα στην αποικοδόμηση οδηγεί στη συσσώρευση τους ανά τα διάφορα οικοσυστήματα του πλανήτη. Η διαχείριση των πλαστικών απορριμμάτων πραγματοποιείται κατά βάση με συμβατικές μεθόδους που συνοδεύονται από αξιοσημείωτες αρνητικές επιπτώσεις στο περιβάλλον και γι’ αυτό η εύρεση καινοτόμων μεθόδων με περιορισμένο περιβαλλοντικό αντίκτυπο έχει ελκύσει σημαντικό μέρος της επιστημονικής κοινότητας. Η ενσωμάτωση και αξιοποίηση βιοκαταλυτών για τη διάσπαση των πλαστικών υλικών τους έχει καταδείξει ως την πλέον φιλικότερη προς το περιβάλλον μέθοδο διαχείρισης τους. Υπό αυτό το πρίσμα, στόχος της παρούσας ερευνητικής μελέτης ήταν η ανακάλυψη και ο χαρακτηρισμός οξειδωτικών ενζύμων ικανών για αποικοδόμηση ή/και τροποποίηση πολυολεφινών. Προς την επίτευξη αυτού, μελετήθηκαν πέντε οξειδοαναγωγάσες από μύκητες του γένους Aspergillus και από το έντομο του είδους Galleria mellonella. Οι τέσσερεις εξ αυτών εντοπίστηκαν βιβλιογραφικά και επιλέχθηκαν λόγω των ενδείξεων για πιθανή δράση τους είτε σε πολυολεφινικά υλικά είτε σε παρεμφερή αλειφατικά υποστρώματα. Συγκεκριμένα, οι τρεις (Α55, Α57 και Α58) προέρχονται από τον μύκητα Aspergillus transmontanensis και ανήκουν στην κατηγορία των μη ειδικών υπεροξυγενασών (Unspecific Peroxygenases - UPOs) ενώ η τελευταία (Demetra) αποτελεί χαλκοένζυμο της κατηγορίας των αρυλφορινών από το είδος Galleria mellonella, όπου πρωτεομικές αναλύσεις κατέδειξαν την ομολογία του με τις προφαινολοξειδάσες. Ακολούθως αναζητήθηκαν υψηλής ομολογίας αλληλουχίες με αυτή του ενζύμου Demetra μέσω του βιοπληροφορικού εργαλείου BLAST® επιλέχθηκε το μεταλλοένζυμο AsqI από τον μύκητα Aspergillus nidulans για να διερευνηθεί το ενδεχόμενο παρόμοιας δράσης του με το αρχικό ένζυμο. Αρχικά, τα γονίδια για την κωδικοποίηση της έκφρασης των ανωτέρω ενζύμων συντέθηκαν χημικά, αλλά και κλωνοποιήθηκαν σε πλασμιδιακό φορέα pPICZα A, από την εταιρεία GenScript. Έπειτα, με τους συντεθειμένους φορείς μετασχηματίστηκαν επιδεκτικά κύτταρα X33 του ζυμομύκητα Pichia pastoris μέσω ηλεκτροδιάτρησης και πραγματοποιήθηκε η ετερόλογη έκφραση των ενζύμων με συμβατικά πρωτόκολλα. Ακολούθησε διαλογή εκ των μετασχηματισμένων στελεχών ως προς την έκφραση και την ανάπτυξη και εν συνεχεία πραγματοποιήθηκε βελτιστοποίηση του πρωτοκόλλου έκφρασης με την εξέταση παραμέτρων, διαφορετικών για κά-θε είδος ενζύμου, όπως η θερμοκρασία, ο χρόνος επαγωγής, η προσθήκη και η συγκέντρωση των κατάλληλων συμπαραγόντων. Τα εκφρασμένα ένζυμα απομονώθηκαν με χρωματογραφία συγγένειας και προσδιορίστηκε το μοριακό βάρος και η καθαρότητα τους με ηλεκτροφόρηση σε πήκτωμα πολυακρυλαμιδίου υπό αποδιατακτικές συνθήκες. Για τις UPOs επιβεβαιώθηκε η ορθή έκφραση τους ενώ παρουσίασαν ενεργότητα σε υπόστρωμα ABTS. Το ένζυμο Demetra εκφραζόταν σε μικρότερο μοριακό βάρος εκ του αναμενόμενου, ενώ το AsqI κατέστη αδύνατο να εκφραστεί. Τα τελευταία δεν παρουσίασαν ενεργότητα σε κατεχόλη, σύνηθες υπόστρωμα για τη μελέτη δράσης φαινολοξειδασών. Αντλήθηκαν επίσης φασματοφωτομετρικά δεδομένα στα οποία αναγνωρίστηκαν οι αναμενόμενες χαρακτηριστικές κορυφές των UPOs και του ενζύμου Demetra εξαιτίας της δέσμευσης τους με τους αντίστοιχους συμπαράγοντες (αίμη και χαλκός αντίστοιχα). Μελετήθηκε η δράση των ενζύμων σε αλειφατικά υποστρώματα. Για τις UPOs χρησιμοποιήθηκαν αλκάνια (κ-εννιάνιο, κ-δωδεκάνιο και κ-εικοσιτετράνιο) και οι αντιδράσεις πραγματοποιήθηκαν στους 30 °C για 24 h σε ρυθμιστικό διάλυμα φωσφορικών ιόντων 50 mM με pH 7,0. Η δράση τους εξετάστηκε με την ανίχνευση πιθανών προϊόντων των αλκανίων μέσω Gas Chromatography – Mass Spectroscopy. Για το ένζυμο Demetra χρησιμοποιήθηκε σκόνη LDPE με τις συνθήκες των αντιδράσεων να είναι 30 °C για 3 μέρες και pH 6,0 με τη χρήση ρυθμιστικού διαλύματος φωσφορικών ιόντων 100 mM. Η ικανότητα του ενζύμου αυτού να δράσει επί του πολυμερικού υλικού εξετάστηκε με την διερεύνηση πιθανών τροποποιήσεων στο χρησιμοποιούμενο LDPE μέσω Fourier-Transform Infrared Spectroscopy. Τα ένζυμα A55 και Α58 παρουσίασαν δράση επί του κ-εικοσιτετρανίου καθότι ανιχνεύτηκαν ως πιθανά προϊόντα αντίστοιχου ή μικρότερου αριθμού ατόμων άνθρακα λιπαρών οξέων. Το ένζυμο Demetra παρουσίασε αρκετά περιορισμένη μεταβολή του φάσματος του τυπικού LDPE, η οποία δεν μπορεί να συνδεθεί με κάποια γνωστή τροποποίηση επί του μορίου του πολυμερούς και ίσως να δύναται να θεωρηθεί ως αμελητέα. Εν κατακλείδι, αξιοσημείωτη αναδείχθηκε η παραγωγή πιθανών προϊόντων οξυγόνωσης και οξείδωσης του κ-εικοσιτετρανίου μέσω της καταλυτικής δραστηριότητας των UPOs Α55 και Α58, η οποία μπορεί να αποτελέσει αφορμή για την περαιτέρω μελέτη της δράσης τους στην αποικοδόμηση πολυολεφινών.	el
heal.abstract	The ability of synthetic polymers to resist natural degradation and their extensive use as core packaging and manufacturing materials have driven the upsurgence of many critical environmental problems related to the destabilization of the ecosystems that tend to accumulate plastic waste. Plastic waste management has been conventionally carried out via methods that seem to have considerable environmental implications; thus, substantial portion of the scientific community is focused on finding novel methods for the management and degradation of synthetic polymers. As such, during recent decades the use of biocatalysts has arisen as a fitting candidate for a rather environmentally friendly and relatively economical way of degrading plastic materials. In this context, the purpose of this diploma thesis is the discovery and the biochemical characterization of oxidative enzymes capable of either biodegrading or modifying polyolefins. To that end, five oxidoreductases were studied from fungi of the genus Aspergillus and the insect species Galleria mellonella; four of these were identified through bibliographic research and were chosen due to evidence of their action on polyolefins or aliphatic substrates. More specifically, of these enzymes, the A55, A57 and A58 are characterized as unspecified peroxygenases (UPOs) from the fungus Aspergillus transmontanensis, while the enzyme Demetra is a copper en-zyme and is considered an arylphorin of the species Galleria mellonella homologous to prophenoloxidases. However, the fifth enzyme (AsqI) was chosen through the search for high homologue proteins to the sequence of Demetra using the bioinformatic tool BLAST®, in order to investigate if it possesses similar activity with the above enzyme. The heterologous expression of these enzymes was carried out by chemically synthesizing and cloning the necessary genes in plasmid vectors pPICZα A from the company GenScript, which were then used to transform competent X33 Pichia pastoris yeast cells through electroporation. Subsequently, a screening of the different transformed stems was executed and it was followed by an optimization of the expression protocols considering different expression parameters such as temperature, induction time, introduction and concentration of the required enzyme cofactors. The heterologous expressed enzymes were isolated with immobilized metal affinity chromatography, all the while their molecular was determined through polyacrylamide gel electrophoresis. It was determined that the UPOs were properly expressed and, additionally, they presented activity by oxidizing ABTS. However, Demetra was being expressed with lower molecular weight than the expected value, while AsqI was inadequately expressed. None of these two enzymes presented activity by oxidizing catechol, a common substrate for phenoloxidase activity assays. Nonetheless, spectrophotometric data indicated the expected characteristic peaks of the UPOs and Demetra stemming from their interaction with the corresponding cofactors. Afterwards, the expressed enzymes reacted with different substrates; alkanes (n-nonane, n-dodecane and n-tetracosane) were used as aliphatic substrates for the UPOs with reaction conditions at 30 °C for 24 h in 50 mM Sodium Phosphate buffer of pH 6,0 and their possible products were identified using Gas Chromatography – Mass Spectroscopy. The enzyme Demetra reacted with LDPE pellets at 30 °C for 3 days in Potassium Phosphate buffer of pH 7,0. The identification of possible modifications to the added LDPE was carried out through Fourier-Transform Infrared Spectroscopy. The enzymes A55 and A58 presented activity in degrading or modifying n-tetracosane by the identification of fatty acids with the same or smaller carbon chain as possible products. On the other hand, the activity of the enzyme Demetra was correlated with a relatively limited modification to the FTIR spectrum of the reactive LDPE, which could not be definitively linked to a known type of degradation of the polyethylene molecule. In summary, the oxygenation and oxidation of n-tetracosane by the UPOs A55 and A58 arose as a key result to actuate further investigation of the role of these enzymes in the biodegradation of polyolefins.	en
heal.advisorName	Τόπακας, Ευάγγελος	el
heal.advisorName	Topakas, Evaggelos	en
heal.committeeMemberName	Τόπακας, Ευάγγελος	el
heal.committeeMemberName	Νικολάιβιτς, Ευστράτιος	el
heal.committeeMemberName	Κόλλια, Κωνσταντίνα	el
heal.academicPublisher	Εθνικό Μετσόβιο Πολυτεχνείο. Σχολή Χημικών Μηχανικών. Τομέας Σύνθεσης και Ανάπτυξης Βιομηχανικών Διαδικασιών (IV). Εργαστήριο Βιοτεχνολογίας	el
heal.academicPublisherID	ntua
heal.numberOfPages	184 σ.	el
heal.fullTextAvailability	false