Εντοπισμός, παραγωγή και χαρακτηρισμός νέων θερμοσταθερών υδρολασών από τον μεσόφιλο μικροοργανισμό Bacillus safensis.

Γεωργακοπούλου, Γεωργία; Georgakopoulou, Georgia

dc.contributor.author	Γεωργακοπούλου, Γεωργία	el
dc.contributor.author	Georgakopoulou, Georgia	en
dc.date.accessioned	2024-05-13T08:50:29Z
dc.date.available	2024-05-13T08:50:29Z
dc.identifier.uri	https://dspace.lib.ntua.gr/xmlui/handle/123456789/59327
dc.identifier.uri	http://dx.doi.org/10.26240/heal.ntua.27023
dc.rights	Αναφορά Δημιουργού-Μη Εμπορική Χρήση-Όχι Παράγωγα Έργα 3.0 Ελλάδα	*
dc.rights.uri	http://creativecommons.org/licenses/by-nc-nd/3.0/gr/	*
dc.subject	GH5 beta-glucanase	en
dc.subject	Biochemical characterization	en
dc.subject	Beta-glucan	en
dc.subject	Thermodynamics	en
dc.subject	Bacillus safensis	en
dc.subject	Παραγωγή ενζύμου	el
dc.subject	Βιοχημικός χαρακτηρισμός	el
dc.subject	β-γλουκανάση	el
dc.subject	β-γλουκάνη	el
dc.subject	Θερμοδυναμικές παράμετροι	el
dc.title	Εντοπισμός, παραγωγή και χαρακτηρισμός νέων θερμοσταθερών υδρολασών από τον μεσόφιλο μικροοργανισμό Bacillus safensis.	el
heal.type	bachelorThesis
heal.classification	Βιοτεχνολογία	el
heal.language	el
heal.access	free
heal.recordProvider	ntua	el
heal.publicationDate	2023-09-28
heal.abstract	Η παρούσα διπλωματική εργασία αφορά στη μελέτη μίας β-γλουκανάσης (BsGH5) της οικογένειας 5 των γλυκοσιδικών υδρολασών (GH5) από το βακτήριο Bacillus safensis. Αρχικά, πραγματοποιήθηκε απομόνωση από τον μικροοργανισμό, ανασυνδυασμός και υπερπαραγωγή του συγκεκριμένου ενζύμου. Το γονίδιο του ενζύμου κλωνοποιήθηκε σε πλασμιδιακό φορέα pΕΤ15b, ο οποίος με θερμοεπαγώμενο μετασχηματισμό εισήχθη σε δεκτικά κύτταρα E. Coli BL21. Τα βακτηριακά κύτταρα εκφράζουν το ένζυμο της β-γλουκανάσης και χρησιμοποιούνται ως εμβόλιο στις καλλιέργειες που μελετήθηκαν. Η κυτταρική καλλιέργεια των ανασυνδυασμένων κυττάρων παρήχθη σε μεγαλύτερη κλίμακα, ακολουθούμενη από την απομόνωση, τον καθαρισμό και τον χαρακτηρισμό της πρωτεΐνης. Η απομόνωση πραγματοποιήθηκε με σπάσιμο των κυττάρων με υπερήχους, ενώ ο καθαρισμός περιλάμβανε τη διαβίβαση μέσα από στήλη νικελίου, τη συλλογή των κλασμάτων που περιείχαν την πρωτεΐνη και τη συμπύκνωση με χρήση διάταξης Amicon. To μοριακό βάρος της BsGH5 προσδιορίστηκε μέσω ηλεκτροφόρησης SDS-PAGE και βρέθηκε ίσο με 45 kDa. Έπειτα, ακολούθησε χαρακτηρισμός της BsGH5, όπου μελετήθηκαν η βέλτιστη θερμοκρασία δράσης της (60οC), το βέλτιστο pH δράσης της (pH=6), καθώς και η σταθερότητά της σε διαφορετικά pH (3 έως 9) και θερμοκρασίες (40 έως 70οC). Στους 40οC η BsGH5 διατηρεί το 50% της σχετικής της ενεργότητας μετά από επώαση για 7 μέρες με χρόνο ημιζωής ίσο με 11600 λεπτά, ενώ η δραστικότητά της μειώνεται κατά 20% μετά από επώαση σε ρυθμιστικό διάλυμα φωσφορικών με pH 5-7 για 24 ώρες, στους 4οC. Η ενέργεια θερμικής απενεργοποίησης του ενζύμου (E_(α_d ) ) βρέθηκε ίση με 248.6 kJ/mol και με βάση αυτήν και τις σταθερές θερμικής απενεργοποίησης (k_d ) υπολογίστηκαν οι μεταβολές των θερμοδυναμικών μεγεθών ενθαλπία (ΔH), εντροπία (ΔS) καθώς και η ελεύθερη ενέργεια Gibbs (ΔG*). Η BsGH5 εμφάνισε μέγιστη δράση στο υπόστρωμα της β-γλουκάνης, παρουσίασε μείωση της ενεργότητάς της κατά 40% κατά τη χρήση επεξεργασμένης κυτταρίνης (PASC), ενώ δεν παρατηρήθηκε δραστικότητα σε κυτταρινικά υποστρώματα. Οι κινητικές παράμετροι K_m και v_max υπολογίστηκαν μέσω της υδρόλυσης της β-γλουκάνης και βρέθηκαν ίσες με 33.38 mg/mL και 9.35 U/mL, αντίστοιχα. Κατόπιν μελέτης επίδρασης διαφόρων μεταλλοϊόντων στην ενεργότητα της BsGH5, αποδείχθηκε, ότι τα ιόντα Mn2+ (MnCl2), Mg2+ (MgSO4), Fe2+ και Ba2+ ενεργοποιούν την BsGH5, ενώ όλα τα υπόλοιπα έχουν ανασταλτική δράση, το καθένα σε διαφορετικό ποσοστό. Εκτός αυτών, ο επιφανειοδραστικός παράγοντας SDS φάνηκε να έχει ελάχιστη επίδραση στο ένζυμο μειώνοντας τη σχετική ενεργότητά του στο 90% της αρχικής, ενώ, κατά την παρουσία του EDTA, η εναπομείνουσα ενεργότητα ήταν περίπου το 75% της αρχικής. Παράλληλα, εντοπίστηκαν τα προϊόντα υδρόλυσης της αντίδρασης του ενζύμου με το υπόστρωμα β-γλουκάνη, τα οποία ήταν γλυκόζη, κελλοβιόζη, κελλοτριόζη και κελλοτετραόζη. Η BsGH5 μελετήθηκε ως προς την παραγωγικότητά της και την ικανότητά της να ροφάται σε υπόστρωμα μικροκρυσταλλικής κυτταρίνης Avicel, όπου και παρατηρήθηκε, ότι η ρόφηση της πρωτεΐνης πραγματοποιείται στο 50% ανεξάρτητα από την αρχική της συγκέντρωση. Τέλος, εντοπίστηκε η πιθανή τρισδιάστατη δομή της πρωτεΐνης μέσω του προγράμματος Swiss model tool ExPASY, ενώ, με χρήση του προγράμματος UniProt, έγινε σύγκριση της BsGH5 με ένζυμα διαφορετικών μικροοργανισμών που διαθέτουν παρόμοια αμινοξική αλληλουχία, με τα μεγαλύτερα ποσοστά ομοιότητας να αντιστοιχούν σε δύο ένδο-1,4-β-μαννοζιδάσες προέρχονται από τους μικροοργανισμούς Bacillus safensis (A0A5C0WLE0, 97% ομοιότητα) και Bacillus licheniformis (Q65JI6, 73% ομοιότητα)	el
heal.abstract	This present diplomatic thesis concerns the study of a β-glucanase (BsGH5) from family 5 of glycosidic hydrolases (GH5) produced by the bacterium Bacillus safensis. Initially, isolation from the microorganism, ligation, and overproduction of this specific enzyme were carried out. The enzyme's gene was cloned into a plasmid vector pET15b, which was thermoelectrically transformed into E. coli BL21 competent cells. The cell culture of the recombinant cells was produced on a larger scale, followed by isolation, purification, and characterization of the protein. Cells were lysed by sonication on ice, while they were then purified using a nickel column and concentrated using an Amicon device. The molecular mass of BsGH5 was estimated by SDS-PAGE electrophoresis at 45 kDa. Subsequently, characterization of BsGH5 followed, including the study of its optimum operating temperature (60°C), optimum pH (pH=6), as well as its stability at different pH values (3 to 9) and temperatures (40 to 70°C). At 40°C, BsGH5 retains 50% of its initial activity after incubation for 7 days, with a half-life of 11,600 minutes, while its activity decreases by 20% after incubation in a pH range of 5-7 for 24 hours at 4°C. The thermal deactivation energy (Eαd ) was found 248.6 kJ/mol, and based on this and the thermal deactivation constants (kd ), the changes in thermodynamic parameters enthalpy (ΔH), entropy (ΔS), and Gibbs free energy (ΔG*) were calculated. BsGH5 exhibited maximum activity on β-glucan, with a 40% decrease in its activity when using processed cellulose (PASC), and showed no activity on cellulose substrates. The kinetic parameters Km and vmax were calculated by hydrolysis of β-glucan and were determined equal to 33.38 mg/mL and 9.35 U/mL, respectively. The effect of various metal ions on the activity of BsGH5 was studied, demonstrating that Mn2+ (MnCl2), Mg2+ (MgSO4), Fe2+, and Ba2+ ions activate BsGH5, while all the others have inhibitory effects. Additionally, the surfactant SDS had minimal effect on the enzyme, reducing its relative activity to 90%, while in the presence of EDTA, the remaining activity was approximately 75% of the initial activity. Meanwhile, the hydrolysis products of the enzyme reaction with the β-glucan substrate were identified as glucose, cellobiose, cellotriose and cellotetraose. BsGH5 was studied for its processivity and its ability to degrade microcrystalline cellulose substrate Avicel, where it was observed that protein degradation occurs at 50%. Finally, the possible three-dimensional structure of the protein was identified using the Swiss model tool ExPASY. BsGH5 was compared with enzymes from different microorganisms with similar amino acid sequences using the UniProt program, with the highest similarity percentages corresponding to two endo-1,4-β-mannosidases originating 4 from the microorganisms Bacillus safensis (A0A5C0WLE0, 97% similarity) and Bacillus licheniformis (Q65JI6, 73% similarity).	en
heal.advisorName	Μαμμά, Διομή	el
heal.committeeMemberName	Χατζηνικολάου, Δημήτριος	el
heal.committeeMemberName	Κορδάτος, Κωνσταντίνος	el
heal.academicPublisher	Εθνικό Μετσόβιο Πολυτεχνείο. Σχολή Χημικών Μηχανικών. Τομέας Σύνθεσης και Ανάπτυξης Βιομηχανικών Διαδικασιών (IV). Εργαστήριο Βιοτεχνολογίας	el
heal.academicPublisherID	ntua
heal.numberOfPages	90 σ.	el
heal.fullTextAvailability	false