Ενίσχυση της δυνατότητας αποικοδόμησης πλαστικών από μια εστεράση του φερουλικού οξέος από το μύκητα Fusarium oxysporum με μεθόδους πρωτεϊνικής μηχανικής

Ριζόπουλος, Θεόδωρος; Rizopoulos, Theodoros

dc.contributor.author	Ριζόπουλος, Θεόδωρος	el
dc.contributor.author	Rizopoulos, Theodoros	en
dc.date.accessioned	2024-05-14T09:06:51Z
dc.date.available	2024-05-14T09:06:51Z
dc.identifier.uri	https://dspace.lib.ntua.gr/xmlui/handle/123456789/59357
dc.identifier.uri	http://dx.doi.org/10.26240/heal.ntua.27053
dc.rights	Αναφορά Δημιουργού - Παρόμοια Διανομή 3.0 Ελλάδα	*
dc.rights.uri	http://creativecommons.org/licenses/by-sa/3.0/gr/	*
dc.subject	Πολυ(τερεφθαλικός αιθυλεστέρας)	el
dc.subject	Πλαστικά	el
dc.subject	Βιοαποικοδόμηση	el
dc.subject	Μεταλλαξιγένεση	el
dc.subject	Πρωτεϊνική μηχανική	el
dc.title	Ενίσχυση της δυνατότητας αποικοδόμησης πλαστικών από μια εστεράση του φερουλικού οξέος από το μύκητα Fusarium oxysporum με μεθόδους πρωτεϊνικής μηχανικής	el
heal.type	bachelorThesis
heal.classification	Βιοτεχνολογία	el
heal.language	el
heal.access	campus
heal.recordProvider	ntua	el
heal.publicationDate	2023-09-29
heal.abstract	Η αυξανόμενη χρήση πλαστικών υλικών καθώς και η συσσώρευσή τους στο περιβάλλον, λόγω της αντίστασης που επιδεικνύουν στη βιοαποικοδόμηση, αποτελούν μια σοβαρή περιβαλλοντική πρόκληση παγκόσμιας κλίμακας. Την τελευταία δεκαετία, η αξιοποίηση μικροοργανισμών και των ενζυμικών συστημάτων που επιστρατεύουν στη βιοαποικοδόμηση συνθετικών πολυμερών κερδίζει έδαφος, καθώς αποτελεί μια «πράσινη» εναλλακτική έναντι των συμβατικών μεθόδων διαχείρισης, οι οποίες παρουσιάζουν αρκετά μειονεκτήματα, τόσο από οικονομική όσο και από περιβαλλοντική άποψη. Στην παρούσα διπλωματική, μελετάται ένα ένζυμο από τον μύκητα Fusarium oxysporum (FoFaeC), εμπλεκόμενο στη φυσική αποικοδόμηση λιγνοκυτταρινούχου βιομάζας. Από μελέτη ενζυμικών συνεργιτισμών ανακαλύφθηκε πως η FoFaeC είναι ικανή να διασπά το κύριο προϊόν υδρόλυσης του πολυ(τερεφθαλικού αιθυλεστέρα), το MHET. Πράγματι, η FoFaeC είναι δομικά όμοια με ένα ένζυμο βακτηριακής προέλευσης (IsMHETase), το οποίο εξειδικεύεται στη διάσπαση του MHET. Από βιοπληροφορική σύγκριση των δύο ενζύμων σχεδιάστηκαν τρείς σημειακές μεταλλάξεις στην αμινοξική αλληλουχία της FoFaeC (G122S, T202E, I415F) με στόχο την περεταίρω προσομοίωση του ενεργού της κέντρου με αυτό της IsMHETase, προκειμένου να εξεταστεί η επιρροή στη δράση έναντι στο MHET. Αρχικά, τα γονίδια έκφρασης των επτά μελετώμενων μεταλλαγμάτων της FoFaeC (G122S, T202E, I415F, G122S/T202E, G122S/I415F, T202E/I415F και G122S/T202E/I415F) εισήχθησαν στον πλασμιδιακό φορέα pPICZα A. Ακολούθησε ο μετασχηματισμός τους, με τη μέθοδο της ηλεκτροδιάτρησης, σε ζυμομύκητα Pichia pastoris (στέλεχος wild type X-33). Το βέλτιστο μετασχηματισμένο στέλεχος του κάθε μεταλλάγματος επιλέχθηκε μετά από διαλογή. Κατά τη διαδικασία αυτή πραγματοποιήθηκε ετερόλογη έκφραση, σε μικρή κλίμακα (50 mL), ορισμένων μετασχηματισμένων στελεχών του κάθε ενζύμου, εξετάζοντας την κυτταρική ανάπτυξη, την πρωτεϊνική συγκέντρωση και την υδρολυτική τους δράση σε πρότυπο εστερικό υπόστρωμα pNPA. Εν τέλει, έγινε ταυτοποίηση της παραγόμενης πρωτεΐνης μέσω ηλεκτροφόρησης σε πηκτή πολυακρυλαμιδίου υπό αποδιατακτικές συνθήκες (SDS-PAGE). Έπειτα, το πρωτόκολλο έκφρασης, σε μεγαλύτερη κλίμακα (500 mL), για το κάθε μετάλλαγμα υποβλήθηκε σε βελτιστοποίηση. Η μείωση της θερμοκρασίας από τους 30οC στους 26οC, κατά την επαγωγή της έκφρασης, καθώς και πρόωρος τερματισμός επαγωγής ορισμένων μεταλλαγμάτων (2 ημέρες για την G122S/T202E/I415F και 3 ημέρες για την G122S/T202E, αντί για 4) βελτίωσε σημαντικά την ακεραιότητα και την ενεργότητα των μεταλλαγμένων ενζύμων, συγκριτικά με το συμβατικό πρωτόκολλο έκφρασης. Η μετάλλαξη I415F, δεν κατάφερε να εκφραστεί αποτελεσματικά, παρά τις τροποποιήσεις του πρωτοκόλλου. Στη συνέχεια, τα μεταλλάγματα, πέραν του I415F, καθώς και η WT FoFaeC απομονώθηκαν και ακολούθησε ο βιοχημικός χαρακτηρισμός τους. Οι σημειακές μεταλλάξεις δεν μετέβαλλαν τη βέλτιστη θερμοκρασία δράσης του ενζύμου, η οποία εμφανίζεται στους 60οC. Από τους 70οC και άνω, η ενεργότητα μειώνεται κάτω του 50% της βέλτιστης, με τις μεταλλάξεις G122S και T202E να διατηρούν ελαφρώς καλύτερα την ενεργότητα, σε αντίθεση με τη WT FoFaeC και τα υπόλοιπα μεταλλάγματα. Επιπλέον, μελέτη θερμοσταθερότητας των μεταλλαγμάτων G122S και T202E έδειξε πως η μετάλλαξη T202E έντεινε την αστάθεια του ενζύμου ήδη από τους 50οC, ενώ η μετάλλαξη G122S καθώς και η WT FoFaeC παρουσίασαν καλύτερη σταθερότητα στη θερμοκρασία αυτή. Τέλος, τα μεταλλάγματα υποβλήθηκαν σε αντίδραση με το MHET (1,2 mM στο αντιδρών διάλυμα με 50 nM ενζύμου), όπου διαπιστώθηκε πως όλα, πέραν του G122S, δεν κατάφεραν να υδρολύσουν το MHET προς TPA, βάσει των αποτελεσμάτων της χρωματογραφίας υψηλής απόδοσης (HPLC). Παρόλα αυτά, τόσο η WT FoFaeC όσο και το μετάλλαγμα G122S παρουσίασαν αύξηση της συγκέντρωσης του παραγόμενου TPA με το χρόνο. Μάλιστα, η ειδική ενεργότητα υπολογίστηκε 0,129±0,002 Units/mg για την G122S και 0,099±0,001 Units/mg για τη WT FoFaeC, αναδεικνύοντας το γεγονός ότι η πρωτεϊνική μηχανική του ενζύμου οδήγησε σε μια ελαφριά βελτίωση της καταλυτικής του ικανότητας, έναντι στο MHET.	el
heal.abstract	The increasing use of plastic materials and their accumulation in the environment, due to their resistance to biodegradation, poses a serious global environmental challenge. Over the past decade, the utilization of microorganisms and their enzymatic systems employed in the biodegradation of synthetic polymers has been gaining ground, as a "greener" alternative to conventional management methods, which present several disadvantages, both from an economic and environmental perspective. In this thesis, an enzyme from the fungus Fusarium oxysporum (FoFaeC), involved in the natural biodegradation of lignocellulosic biomass, is studied. Enzymatic synergy studies revealed that FoFaeC is capable of hydrolyzing the main hydrolysis product of polyethylene terephthalate, MHET. Indeed, FoFaeC shares structural similarity with a bacterial enzyme (IsMHETase) specialized in MHET degradation. Through bioinformatics comparison of the two enzymes, three mutations in the amino acid sequence of FoFaeC (G122S, T202E, I415F) were designed to further simulate its active site with that of IsMHETase’s, aiming to investigate their impact on MHET catalysis. Initially, the genes encoding the seven examined mutants of FoFaeC (G122S, T202E, I415F, G122S/T202E, G122S/I415F, T202E/I415F, and G122S/T202E/I415F) were inserted into the plasmid vector pPICZα A, followed by their transformation in Pichia pastoris (wild type strain X-33), through electroporation. The optimal transformed strain of each mutation was selected through screening. During this process, heterologous expression of certain transformed strains of each enzyme was performed on a small scale (50 mL), evaluating cellular growth, protein concentration, and hydrolytic activity on a p-nitrophenyl acetate (pNPA) ester substrate. Lastly, protein identification was carried out through electrophoresis (SDS-PAGE), under denaturing conditions. Subsequently, the heterologous expression protocol for each mutant was subjected to optimization, on a bigger scale (500 mL). Reducing the temperature from 30°C to 26°C during the induction of expression, as well as premature induction termination of certain mutants (2 days for G122S/T202E/I415F and 3 days for G122S/T202E, instead of 4), significantly improved the integrity and activity of the mutated enzymes, compared to the conventional expression protocol. The I415F mutation could not be expressed efficiently, despite protocol modifications. The mutants, except for I415F, as well as WT FoFaeC were then purified, isolated and biochemically characterized. The designed point mutations did not alter the optimum temperature of the enzyme, which occurs at 60°C. From 70°C and above, the activity decreases below 50% of the optimum, with the G122S and T202E mutations showing slightly better activity hold, compared to WT FoFaeC and the remaining mutants. Furthermore, thermostability study of the G122S and T202E mutations showed that the latter led to an increased instability of the enzyme from 50°C, while the G122S mutant as well as the WT FoFaeC show better stability at this temperature. Finally, the mutants reacted with MHET substrate (1.2 mM in the reaction solution with 50 nM enzyme), where it was observed that all of them, except for G122S, were unable to hydrolyze MHET into TPA, based on the results of high-performance liquid chromatography (HPLC). However, both WT FoFaeC and the G122S mutant showed an increase in the concentration of produced TPA over time. In fact, the specific activity was calculated 0.129±0.002 Units/mg for G122S and 0.099±0.001 Units/mg for WT FoFaeC, highlighting that protein engineering of the enzyme led to a slight improvement in its catalytic capability towards MHET.	en
heal.advisorName	Topakas, Evangelos	en
heal.committeeMemberName	Vouyiouka, Stamatina	en
heal.committeeMemberName	Charitidis, Costas	en
heal.academicPublisher	Εθνικό Μετσόβιο Πολυτεχνείο. Σχολή Χημικών Μηχανικών. Τομέας Σύνθεσης και Ανάπτυξης Βιομηχανικών Διαδικασιών (IV). Εργαστήριο Βιοτεχνολογίας	el
heal.academicPublisherID	ntua
heal.numberOfPages	136 σ.	el
heal.fullTextAvailability	false