Μελέτη φυτοπαθογόνων μυκητιακών στελεχών για την ικανότητά τους να αποικοδομούν συνθετικά πολυμερή με ταυτόχρονη ταυτοποίηση των ενζύμων που εκφράζονται μέσω ομικών αναλύσεων

Χαντζή, Μαρία; Chantzi, Maria

dc.contributor.author	Χαντζή, Μαρία	el
dc.contributor.author	Chantzi, Maria	en
dc.date.accessioned	2024-05-17T10:45:36Z
dc.date.available	2024-05-17T10:45:36Z
dc.identifier.uri	https://dspace.lib.ntua.gr/xmlui/handle/123456789/59394
dc.identifier.uri	http://dx.doi.org/10.26240/heal.ntua.27090
dc.rights	Αναφορά Δημιουργού-Μη Εμπορική Χρήση-Όχι Παράγωγα Έργα 3.0 Ελλάδα	*
dc.rights.uri	http://creativecommons.org/licenses/by-nc-nd/3.0/gr/	*
dc.subject	Αποικοδόμηση	el
dc.subject	Πολυεστέρες	el
dc.subject	Πολυμερή	el
dc.subject	Πολυαιθυλένιο	el
dc.subject	FT-IR	el
dc.subject	Degradation	en
dc.subject	Polyesters	en
dc.subject	Polymers	en
dc.subject	Polyethylene	en
dc.subject	FT-IR	en
dc.title	Μελέτη φυτοπαθογόνων μυκητιακών στελεχών για την ικανότητά τους να αποικοδομούν συνθετικά πολυμερή με ταυτόχρονη ταυτοποίηση των ενζύμων που εκφράζονται μέσω ομικών αναλύσεων	el
dc.title	Investigating the ability of phytopathogenic fungal strains to degrade synthetic polymers and identification of the enzymes expressed by omic analyses	en
heal.type	bachelorThesis
heal.classification	Αποικοδόμηση συνθετικών πολυμερών - Βιοτεχνολογία	el
heal.classification	Synthetic polymer degradation - Biotechnology	en
heal.language	el
heal.access	free
heal.recordProvider	ntua	el
heal.publicationDate	2023-10-03
heal.abstract	Σκοπός της παρούσας διπλωματικής εργασίας ήταν η μελέτη των ενζύμων που εκφράζονται από μυκητιακά στελέχη και η εφαρμογή τους στην αποικοδόμηση συνθετικών πολυμερών. Για την επίτευξη αυτού, αρχικά, μελετήθηκαν τρία μυκητιακά στελέχη: Aspergillus transmontanensis ΜΜ36, Penicillium citrinum MM41 και Tritirachium sp. Οι μύκητες αναπτύχθηκαν σε υγρές καλλιέργειες, παρουσία πηγών άνθρακα που δύνανται να δρουν επαγωγικά στην έκφραση ενζύμων και έπειτα επωάστηκαν με σκόνη πολυαιθυλενίου (PE) για χρονικό διάστημα 5 ημερών. Ο βαθμός αποικοδόμησης του PE εκτιμήθηκε μέσω του προσδιορισμού της ενεργότητας των παραγόμενων ενζύμων με φασματοφωτομετρικές αναλύσεις, αλλά και μέσω της ανίχνευσης τυχόν αλλαγών στο μοριακό αποτύπωμα του PE με φασματοσκοπία υπερύθρου με μετασχηματισμό Fourier (FT-IR). Στη συνέχεια, αφού αξιολογήθηκαν τα παραπάνω αποτελέσματα το στέλεχος του A. transmontanensis ΜΜ36 επιλέχθηκε για περαιτέρω ανάλυση με σκοπό την ταυτοποίηση των εκκρινόμενων ενζύμων που έχουν την ικανότητα να υποβαθμίζουν το ΡΕ. Για τον λόγο αυτόν, πραγματοποιήθηκε εμβολιασμός υγρών καλλιεργειών με σπόρια του στελέχους και στη συνέχεια το εξωκυτταρικό κλάσμα της καλλιέργειας απομονωνόταν κάθε ημέρα με σκοπό την χρήση του ως βιοκαταλύτης για την αποικοδόμηση σκόνης PE. Αποδείχτηκε, πως τη 2η και την 3η μέρα, παρατηρείται αύξηση της πρωτεϊνικής συγκέντρωσης συνοδευόμενη από αλλαγές στα φάσματα FT-IR. Με βάση αυτά τα αποτελέσματα πραγματοποιήθηκε και πρωτεομική ανάλυση στο εξωκυτταρικό των καλλιεργειών της 2ης και 3ης μέρας. Επιπρόσθετα, εκτός της αποικοδόμησης του ΡΕ, πραγματοποιήθηκαν αντίστοιχες μελέτες για την αποικοδόμηση συνθετικών πολυεστέρων χρησιμοποιώντας τα ένζυμα που εκφράζονται από τα στελέχη του Sarocladium strictum IMNT (Acremonium sp.) και Fusarium oxysporum BPOP18, παρουσία γαλακτώματος πολυουρεθάνης που δρα ως επαγωγέας για την έκφραση ενζύμων με εστερολυτική δράση. Τα εξωκυτταρικά ένζυμα χρησιμοποιήθηκαν και σε αυτή την περίπτωση ως βιοκαταλύτες για την υδρόλυση αποικοδομήσιμων και μη αποικοδομήσιμων πολυεστέρων και συγκεκριμένα των τερεφθαλικού πολυαιθυλενίου υψηλής (PET_cr) και χαμηλής κρυσταλλικότητας (PET_am) καθώς και ΡΕΤ έπειτα από χρήση (PC-PET), πολυκαπρολακτόνης (PCL), πολυγαλακτικού οξέος (PLA), ηλεκτρικού πολυβουτυλενίου (PBS) και πολυ(3-υδροξυβουτυρικού οξέος) (PHB). Ο βαθμός της αποικοδόμησης υπολογίστηκε με βάση την απώλεια βάρους, τη μείωση του μοριακού βάρους και την ανίχνευση προϊόντων αποικοδόμησης με υγρή χρωματογραφία. Επιπλέον, εξετάστηκε σε αντιδράσεις με τα ίδια πολυμερικά υλικά και η συνεργιστική δράση των ενζύμων που εκφράστηκαν από τα δύο αυτά στελέχη. Από τον υπολογισμό του μοριακού βάρους, συμπεραίνεται ότι τα μεγαλύτερα ποσοστά μείωσης των μοριακών βαρών εντοπίστηκαν στην πλειοψηφία των υλικών έπειτα από την ανάμιξη των ενζύμων που εκφράζονται και από τους δύο αυτούς μικροοργανισμούς. Πιο συγκεκριμένα, η μείωση του μέσου βάρους μοριακού βάρους (𝛭��̅w) για το PHB βρέθηκε ίση με 17,9%, για το PBS 28,6% και για το PLA 12,9%. Η μείωση του μέσου αριθμού μοριακού βάρους (𝛭��̅n) για το PHB βρέθηκε ίση με 49,7% και για το PLA 42,5%. Ωστόσο, το PCL vi εμφάνισε μεγαλύτερη μείωση μέσου αριθμού μοριακού βάρους, ίση με 26,1%, έπειτα από επώαση με το εξωκυτταρικό κλάσμα που εκφράζεται από τον μικροοργανισμό S. Strictum IMNT. Από τον έλεγχο της παρουσίας προϊόντων αποικοδόμησης στα δείγματα PET, συμπεραίνεται ότι οι μεγαλύτερες συγκεντρώσεις τερεφθαλικού οξέος (TPA) απελευθερώθηκαν, έπειτα από την επώαση των δειγμάτων με τον S. Strictum IMNT και συγκεκριμένα η ποσότητα TPA που απελευθερώνεται για το PET_am είναι ίση με 0,21 μg/mL, για το PET_cr 0,40 μg/mL και για το PC-PET 0,32 μg/mL. Επιπλέον, δεδομένου ότι η αποικοδόμηση των συνθετικών πολυμερών είναι βασισμένη στους μηχανισμούς αποικοδόμησης της βιομάζας, πραγματοποιήθηκε στα πλαίσια της διπλωματικής εργασίας, η έκφραση μιας θερμόφιλης εστεράσης του γλυκουρονικού οξέος από το Sporotrichum thermophile (StGe2) που ανήκει στην ενζυμική βιβλιοθήκη του εργαστηρίου Βιοτεχνολογίας του Ε.Μ.Π. Η εστεράση εξετάστηκε ξανά με τους προαναφερθέντες πολυεστέρες υδρόλυσης (PHB, PBS, PLA, PCL) και με την πολυουρεθάνη (PU) με τα συμπυκνωμένα εξωκυτταρικά ένζυμα, για τους οποίους άξιο αναφοράς είναι ότι το PCL είχε πάνω από 50% απώλεια βάρους αλλά και με τα εξής πλαστικά: PET_am, PET_cr. Η δράση αυτού του ενζύμου αξιολογήθηκε με τον έλεγχο της παρουσίας προϊόντων αποικοδόμησης στα δείγματα PET, όπου υπήρξε απελευθέρωση μεγάλης συγκέντρωσης μονο-(2- υδροξυαιθυλ)τερεφθαλικού οξέος (MHET) και δευτερευόντως TPA και δι-(2- υδροξυαιθυλ)τερεφθαλικού (BHET). Η ποσότητα των προϊόντων υδρόλυσης του PET, που απελευθερώνεται για το PET_am είναι ίση με 193,74 μg/mL και για το PET_cr 42,30 μg/mL. Τέλος, στα πλαίσια της κυκλικής οικονομίας, υπό το πρίσμα της επαναχρησιμοποίησης των δομικών μονάδων που προκύπτουν από την υδρόλυση των πολυμερών, εξετάστηκε ο βαθμός αποικοδόμησης ενός πολυμερικού μίγματος PET και αμύλου, με τη συνεργιστική δράση των leaf and branch compost cutinase (mutant LCC-ICCG) και εμπορικής αμυλάσης. Σκοπός της μελέτης αυτής ήταν η απόδειξη πως τα υδρολύματα των πολυμερών και συγκεκριμένα του ΡΕΤ, για το οποίο μπορεί να επιτευχθεί υψηλό ποσοστό αποικοδόμησης, μπορούν να ζυμωθούν προς νέα προϊόντα προστιθέμενης αξίας. Για τον λόγο αυτόν, τα υδρολύματα στάλθηκαν σε συνεργαζόμενη ομάδα στο Τεχνολογικό Πανεπιστήμιο του Σάνον, Ιρλανδία (Centre for Polymer Sustainability, PRISM Research Institute, Technological University of the Shannon, Athlone, Ireland), όπου και ζυμώθηκαν προς νανοκυτταρίνη από το βακτηριακό στέλεχος Komagataeibacter sp. αποδεικνύοντας έτσι ότι η ενζυμική αποικοδόμηση συνοδευόμενη από ζύμωση των υδρολυμάτων μπορεί να αποτελέσει μια νέα και οικονομικά βιώσιμη εναλλακτική στην εκμετάλλευση των πλαστικών απορριμμάτων.	el
heal.abstract	The main purpose of the present study was to study the enzymes expressed by fungal strains and their potentials in the degradation of synthetic polymers. In order to achieve this aim, three fungal strains: Aspergillus transmontanensis MM36, Penicillium citrinum MM41 and Tritirachium sp. were studied. These fungi were grown in liquid cultures in the presence of carbon sources, that can act as inducers during enzyme expression, and then incubated with polyethylene (PE) powder for 5 days. The degree of degradation of PE was estimated by determining the activity of the enzymes produced, via spectrophotometric analysis and also by detecting any changes in the molecular fingerprint of PE, by Fourier transform infrared spectroscopy (FT-IR). Subsequently, after evaluating the above results, the strain A. transmontanensis MM36 was selected for further analysis to identify the secreted enzymes that have the ability to degrade PE. For this purpose, inoculation of liquid cultures with spores of the fungus was performed and then the extracellular fraction of the culture was isolated every day for use as a biocatalyst for PE powder degradation. It was shown that on the 2nd and 3rd day, an increase in protein concentration and changes in FT-IR spectra were observed. Based on these results, proteomic analysis was also performed on the extracellular medium of the cultures of the 2nd and 3rd day. In addition, besides the degradation of PE, corresponding studies were carried out for the degradation of synthetic polyesters using the enzymes expressed by Sarocladium strictum (Acremonium sp.) IMNT and Fusarium oxysporum BPOP18 strains, in the presence of polyurethane emulsion, acting as an inducer for the expression of enzymes with esterolytic activity. Extracellular enzymes were also used in this case as biocatalysts for the hydrolysis of degradable and non-degradable polyesters including: polyethylene terephthalate of high (PET_cr) and low crystallinity (PET_am) and post-consumer (PC-PET), polycaprolactone (PCL), polylactic acid (PLA), polybutylene succinate (PBS) and polyhydroxybutyrate (PHB). The degree of degradation was calculated based on weight loss, molecular weight reduction and detection of degradation products by liquid chromatography. In addition, synergism of the enzymes expressed by these two strains was also examined in reactions with the same polymeric materials. It was concluded that the highest rates of molecular weight reduction for all plastics, except PCL, occurred after incubation of the combination of these two microorganisms. More specifically, the decrease of weight average molecular weight (Μ ̅w) for PHB was found to be equal to 17,9%, for PBS 28,6% and for PLA 12,9%. The decrease of number average molecular weight (Μ ̅n) for PHB was found equal to 49,7% and for PLA 42,5%. PCL showed a greater reduction number average molecular weight, equal to 26,1%, after incubation with the extracellular fraction expressed by the microorganism S. strictum IMNT. Moreover, it is concluded that the highest concentrations of terephthalic acid (TPA) were released after incubation with S. strictum IMNT and in particular the amount of TPA released for PET_am is equal to 0,21 μg/mL, for PET_cr 0,40 μg/mL and for PC-PET 0,32 μg/mL. What is more, since the degradation of synthetic polymers is based on the mechanisms of biomass degradation, the expression of a thermophilic esterase of glucuronic acid from Sporotrichum thermophile (StGe2), belonging to the enzyme library of the Biotechnology Laboratory of NTUA was carried out in the context of the thesis. The esterase was re-examined with the above mentioned hydrolysis polyesters (PHB, PBS, PLA, PCL) and with polyurethane (PU) with the concentrated extracellular enzymes, for which it is worth mentioning that PCL had more than 50% weight loss, but also in PET_am, PET_cr substrates. The activity of this enzyme was evaluated by determining products’ degradation in PET samples, where the highest concentration was that of mono-(2-hydroxyethyl) terephtalate (MHET), followed by TPA and bis-(2-hydroxyerthyl) terephthalate (BHET). The amount of PET hydrolysis products released for PET_am is equal to 193,74 μg/mL and for PET_cr 42,30 μg/mL. Finally, in the context of the circular economy, in the light of the reuse of the structural compounds resulting from the hydrolysis of polymers, the degree of degradation of a polymeric mixture of PET and starch was investigated by the synergistic action of leaf and branch compost cutinase (mutant LCC-ICCG) and commercial amylase. The aim of this study was to demonstrate that hydrolysates of polymers, in particular PET, for which a high degradation rate can be achieved, can be fermented into new value-added products. To this end, the hydrolysates were sent to a collaborating group to the Technological University of the Shannon, Ireland (Centre for Polymer Sustainability, PRISM Research Institute, Technological University of the Shannon, Athlone, Ireland), where they were fermented into nanocellulose by the bacterial strain Komagataeibacter sp., thus demonstrating that enzymatic degradation accompanied by fermentation of the hydrolysates can be a new and economically viable alternative to the exploitation of plastic waste.	en
heal.advisorName	Τόπακας, Ευάγγελος	el
heal.committeeMemberName	Κοκόσης, Αντώνης	el
heal.committeeMemberName	Νικολάιβιτς, Ευστράτιος	el
heal.academicPublisher	Εθνικό Μετσόβιο Πολυτεχνείο. Σχολή Χημικών Μηχανικών. Τομέας Σύνθεσης και Ανάπτυξης Βιομηχανικών Διαδικασιών (IV)	el
heal.academicPublisherID	ntua
heal.numberOfPages	132 σ.	el
heal.fullTextAvailability	false