Ακινητοποίηση ενζύμων σε ανθρακούχα υποστρώματα και έλεγχος της βιοχημικής και βιοηλεκτροχημικής σταθερότητάς τους

Κουβαράτη, Θεοδώρα; Kouvarati, Theodora

dc.contributor.author	Κουβαράτη, Θεοδώρα	el
dc.contributor.author	Kouvarati, Theodora	en
dc.date.accessioned	2024-09-03T07:11:40Z
dc.date.available	2024-09-03T07:11:40Z
dc.identifier.uri	https://dspace.lib.ntua.gr/xmlui/handle/123456789/60112
dc.identifier.uri	http://dx.doi.org/10.26240/heal.ntua.27808
dc.rights	Αναφορά Δημιουργού-Μη Εμπορική Χρήση-Όχι Παράγωγα Έργα 3.0 Ελλάδα	*
dc.rights.uri	http://creativecommons.org/licenses/by-nc-nd/3.0/gr/	*
dc.subject	Ηλεκτρόδιο άνθρακα	el
dc.subject	Οξειδοαναγωγικά ένζυμα	el
dc.subject	Ηλεκτροχημικός χαρακτηρισμός	el
dc.subject	Βιοκαταλυτικό σύστημα	el
dc.subject	Carbon electrode	en
dc.subject	Redox enzymes	en
dc.subject	Electrochemical characterization	en
dc.subject	Biocatalytic system	en
dc.subject	Κυκλική βολταμμετρία	el
dc.subject	FTaCV	en
dc.title	Ακινητοποίηση ενζύμων σε ανθρακούχα υποστρώματα και έλεγχος της βιοχημικής και βιοηλεκτροχημικής σταθερότητάς τους	el
dc.title	Immobilization of enzymes on carbon substrate materials and study of their biochemical and electrochemical stability	en
heal.type	bachelorThesis
heal.classification	Χημική Μηχανική	el
heal.classification	Ηλεκτροχημεία	el
heal.classification	Βιοτεχνολογία	el
heal.language	el
heal.access	campus
heal.recordProvider	ntua	el
heal.publicationDate	2023-09-28
heal.abstract	Ηλεκτρόδια από άνθρακα διαφόρων μορφών μελετήθηκαν όσον αφορά την ικανότητα να ακινητοποιηθούν σε αυτά λυτικές μονοοξυγενάσες των πολυσακχαριτών (LPMOs). Τα συστήματα που μελετήθηκαν αποτελούνται από ηλεκτρόδια άνθρακα στα οποία το προς μελέτη ένζυμο βρίσκεται προσδεμένο με ομοιοπολικούς δεσμούς. Τα ηλεκτρόδια άνθρακα που χρησιμοποιούνται χωρίζονται σε τρεις κατηγορίες: τσόχα άνθρακα (carbon felt CF), υαλώδης άνθρακας (glassy carbon, GC) και υπόστρωμα δέσμης ανθρακονημάτων. Σημειώνεται ότι στην περίπτωση της δέσμης ανθρακονημάτων πραγματοποιήθηκαν και δοκιμές όπου η δέσμη ψεκάστηκε με σπρέυ σωματιδίων άνθρακα για αύξηση της ειδικής επιφάνειας. Ο άνθρακας μελετάται ως υπόστρωμα ηλεκτροδίου για την ακινητοποίηση ενζύμου καθώς παρουσιάζει ηλεκτρική αγωγιμότητα, έχει μικρή τιμή ηλεκτρικής αντίστασης, έχει μεγάλη ειδική επιφάνεια και είναι αδιάβρωτος και χημικά αδρανής στις συνθήκες διεξαγωγής των πειραμάτων. Οι λυτικές μονοοξυγενάσες των πολυσακχαριτών (LPMOs) είναι ένζυμα που διασπούν τους γλυκοζιτικούς δεσμούς πολυσακχαριτών, όπως η κυτταρίνη και η ημικυτταρίνη, μέσω οξείδωσης. Στα ηλεκτρόδια άνθρακα γίνεται μελέτη ακινητοποίησης του ενζύμου T thLPMO9G. Για την μελέτη της ηλεκτροχημικής συμπεριφοράς του ενζύμου T thLPMO9G πάνω σε ανθρακούχο υπόστρωμα, χρησιμοποιήθηκε διάταξη τριών ηλεκτροδίων, με ηλεκτρόδιο εργασίας τον άνθρακα με ακινητοποιημένο ένζυμο. Για την χρήση ηλεκτροδίου τσόχας άνθρακα, πριν τη ακινητοποίηση του ενζύμου προηγήθηκε η χημική τροποποίησή του μέσω οξείδωσης για την δημιουργία καρβοξυλικών ομάδων και ο προσδιορισμός της περιεκτικότητας αυτών μέσω αγωγιμομετρικής τιτλοδότησης, ενώ στην συνέχεια η ακινητοποίηση του ενζύμου έγινε με προσρόφηση χωρίς ανάδευση. Για την χρήση ηλεκτροδίου υαλώδους άνθρακα και δέσμης ανθρακονημάτων, η επιφάνεια των ηλεκτροδίων καλύφθηκε με λεπτό υμένιο πολυηλεκτρολύτη Nafion στον οποίο ήταν διαλυμένο το ένζυμο.Για την δημιουργία (CF) γίνεται αρχικά οξείδωση του υλικού με στόχο την δημιουργία καρβοξυλικών ομάδων, σε μείγμα θειικού οξέος 99% και νιτρικού οξέος 65% σε αναλογία 3:1 στους 80 ℃ και τους 120 ℃, για 8, 16 και 64 ώρες. Μετά το πέρας της οξείδωσης και το ξέπλυμα των δειγμάτων η περιετικότητά τους προσδιορίζεται μέσω αγωγιμομετρικής τιτλοδότησης όπου χρησιμοποιείται ως ισχυρό οξύ 20 μL υδροχλωρικού οξέος, HCl 1 Μ και ισχυρή βάση NaOH 0.01 M ως τιτλοδότης. Από την αγωγιμομετρική τιτλοδότηση διαπιστώθηκε ότι η περιεκτηκότητα των καρβοξυλικών ομάδων μπορεί να κυμανθεί από 0,0002 mol -COOH ανά γραμμάριο οξειδωμένου υλικού έως 0,0011 mol -COOH/g υλικού. Παρατηρήθηκε επίσης ότι ο αυξημένος χρόνος οξείδωσης είναι ανάλογος της ποσότητας καρβοξυλικών ομάδων που δημιουργούνται, ενώ οι διαφορές στις θερμοκρασίες οξείδωσης δεν επέφεραν σημαντικές διαφορές. Επιπλέον, η διεξαγωγή και δεύτερης αγωγιμομετρικής τιτλοδότησης στα ίδια δείγματα αμέσως μετά την πρώτη, έδειξε ότι η διαδικασία αυτή πρέπει να πραγματοποιείται μόνο σε υλικά που δεν προορίζονται για επιπλέον μελέτη καθώς μειώνει την ποσότητα των ομάδων που δημιουργήθηκαν σε 0,0001 mol -COOH/g υλικού. Στην συνέχεια τα οξειδωμένα δείγματα προσβάλονται με συνδυασμό των οργανικών ενώσεων 1-αιθυλ-3-(3-διμεθυλαμινοπροπυλ)καρβοδιιμίδιο (EDC) και Ν-υδροξυηλεκτριμίδιο (NHS) σε υπερπερίσσεια, με σκοπό την ενεργοποίηση των καρβοξυλικών ομάδων για την σύζευξη του ενζύμου. Η ακινητοποίηση του ενζύμου λαμβάνει χώρα για 16 ώρες στους 4 ℃ χωρίς ανάδευση, μέσα σε ρυθμιστικό διάλυμα MES 0.2 M. Στην συνέχεια, το δείγμα CF με το ακινητοποιημένο ένζυμο υφίστανται διαδοχικά ξεπλύματα στους 30 ℃, για 30 λεπτά, με ανάδευση 800 rpm μέσα σε MES ώστε να απομακρυνθεί όλη η ποσότητα μη ακινητοποιημένου ενζύμου. Για την βελτιστοποίηση της διαδικασίας της ακινητοποίησης γίνεται δοκιμή ακινητοποίησης του ενζύμου ξυλανάση, που δεν είναι οξειδοαναγωγικό. Μετά την διαδικασία ακινητοποίησης και ξεπλυμάτων που αναφέρθηκε, πραγματοποιείται αντίδραση του κάθε δείγματος με υπόστρωμα ξυλάνης και η ανίχνευση της συνολικής ποσότητας των αναγωγικών σακχάρων προϊόντων των αντιδράσεων γίνεται με την φωτομετρική μέθοδο 3,5-δινιτροσαλικυλικού οξέος (DNS). Από την μέθοδο αυτή φαίνεται ότι το δείγμα CF με το ένζυμο παρήγαγε περισσότερα προϊόντα από το τελευταίο ξέπλυμα, επομένως η ακινητοποίηση ήταν πετυχημένη και το ένζυμο παρέμεινε ενεργό. Συμπληρωματικά, τα προϊόντα αναλύθηκαν και με Χρωματογραφία υψηλής απόδοσης ανιόντο-ανταλλαγής συζευγμένη με αμπερομετρικό ανιχνευτή παλμού (Dionex) από την οποία ταυτοποιήθηκαν και ποσοτικοποιήθηκαν τα παραγόμενα οξειδωμένα προϊόντα της αντίδρασης. Πράγματι, η ποσότητα ξυλόζης στο δείγμα CF βρέθηκε πάνω από εφταπλάσια συγκριτικά με το τελευταίο ξέπλυμα. Σε πλήρη αντιστοιχία με την μελέτη της ξυλόζης, γίνεται και η διαδικασία ακινητοποίησης και αντιδράσεων των ενζύμων T thLPMO9G-C1 και T thLPMO9G-C1C4 στο υπόστρωμα άνθρακα. Στην περίπτωση του T thLPMO9G-C1 η ανάλυση Dionex έδειξε πολύ μικρή ποσότητα προϊόντων οξείδωσης για το δείγμα CF (συγκεκριμένα η ακινητοποίηση θεωρείται πετυχημένη κατά 8,4%), γεγονός που υποστηρίζει την πιθανότητα το ένζυμο να χάνει την ενεργότητά του κατά την διαδικασία ακινητοποίησης-ξεπλυμάτων. Στην περίπτωση του T thLPMO9G-C1C4, δεν φαίνεται να υπάρχει θετική απόκριση του συστήματος καθώς το δείγμα CF παρουσιάζει ακριβώς την ίδια παραγωγή προϊόντων οξείδωσης με το αντίστοιχο τυφλό δείγμα. Για την ηλεκτροχημική μελέτη (CF)T thLPMO9G−C1 επιλέχθηκε η κυκλική βολταμμετρία ώστε να ανιχνευθούν οι κορυφές οξείδωσης και αναγωγής του ενζύμου. Όλα τα πειράματα διεξήχθησαν σε εύρος δυναμικού από -0,6 V έως 0,6 V, μέσα σε απαερωμένο με άζωτο ρυθμιστικό διάλυμα οξικού οξέος (acetate buffer) 0.1 M. Aρχικά πραγματοποιούνται τα κυκλικά βολταμμογραφήματα των τυφλών δειγμάτων CF που έχουν υποστεί όλη την διαδικασία οξείδωσης, προσβολής οργανικών ενώσεων και ξεπλυμάτων χωρίς να περιέχουν ακινητοποιημένο ένζυμο. Το αντίστοιχο πείραμα με το δείγμα CF με ένζυμο παρουσιάζει παρόμοια εικόνα με το τυφλό δείγμα, επομένως δεν μπορεί να προσδιοριστεί με σαφήνεια εάν το ένζυμο έχει ή όχι οξειδοαναγωγική δράση. Για αυτό, το δείγμα CF μελετήθηκε στην συνέχεια με την μέθοδο της κυκλικής βολταμμετρίας εναλλασσόμενου ρεύματος με μετασχηματισμό Fourier (FTaCV), με την οποία μειώνονται τα χωρητικά ρεύματα και ενισχύονται τα φαρανταϊκά, ώστε να μπορούν να ανιχνευθούν και πιο ασθενή οξειδοαναγωγικά είδη. Σε αυτή την ανάλυση, για πλάτος ανάλυσης 400 mV, συχνότητα εναλλαγής τάσης 1 Hz και ταχύτητα σάρωσης 5 mV/s, παρατηρήθηκε ενίσχυση του σήματος στις περιοχές τάσης που εμφανίζονταν οι μικρές κορυφές στην κυκλική βολταμμετρία, επομένως συμπεραίνεται ότι η συμπεριφορά αυτή οφείλεται στην παρουσία του ενζύμου. Για την μελέτη και με υμένιο πολυηλεκτρολύτη Nafion έγινε πρώτα έλεγχος της συμπεριφοράς του ηλεκτροδίου με χρήση οξειδοαναγωγικών ενώσεων με γνωστή δράση. Όπως και με την τσόχα άνθρακα, χρησιμοποιήθηκε η τεχνική της κυκλικής βολταμμετρίας σε εύρος δυναμικού από -0,6 V έως 0,6 V. Ως πρότυπες ενώσεις χρησιμοποιήθηκαν το φερροκένιο και το σιδηρικυανιούοχυ κάλιο. Το φερροκένιο διαλύθηκε στο Nafion ενώ για τα σιδηρικυανιούχα ιόντα δημιουργήθηκε υδατικό διάλυμα 0,01 Μ που αναμείχθηκε με Nafion σε αναλογία 1:1. Μικρή ποσότητα από το μείγμα μεταφέρθηκε στο ηλεκτρόδιο και δημιούργησε ένα λεπτό υμένιο. Σε κάθε περίπτωση, στο ηλεκτρόδιο υαλώδους άνθρακα δεν παρατηρήθηκε καμία κορυφή οξείδωσης-αναγωγής, γεγονός που οφείλεται στην μικρή επιφάνεια του ηλεκτροδίου και στην χαμηλή συγκέντρωση του ενεργού είδους μέσα στο υμένιο. Επομένως το ηλεκτρόδιο υαλώδους άνθρακα κρίθηκε ακατάλληλο για την χρήση του με ακινητοποιημένο ένζυμο. Αντίθετα, στο κυκλικό βολταμμογράφημα της δέσμης ανθρακονημάτων παρατηρήθηκαν οι αναμενόμενες κορυφές. Γiα τις δοκιμές του ενζύμου δημιουργήθηκε μείγμα Nafion και υδατικού διαλύματος ενζύμου σε αναλογία 1:1 μέσα στο οποίο βυθίστηκε η δέσμη ανθρακονημάτων για την δημιουργία υμενίου. Η κυκλική βολταμμετρία ηλεκτροδίου ανθρακονημάτων σε συνδυασμό με σπρέυ άνθρακα έδωσε θετικά αποτελέσματα κορυφών οι οποίες οφείλονται ξεκάθαρα στην οξείδωση και αναγωγή του ενζύμου. Ωστόσο, το πείραμα δεν εμφανίζει καλή επαναληψημότητα καθώς πολλοί παράγοντες επηρεάζουν το αποτέλεσμα. Πιο συγκεκριμένα, η μικρή ειδική επιφάνεια του ηλεκτροδίου (π.χ. δέσμη ανθρακονημάτων χωρίς ενίχυση με σπρέυ άνθρακα), η χαμηλή συγκέντρωση του ενζύμου, ο μεγάλος χρόνος παραμονής στον φέροντα ηλεκτρολύτη και η ύπαρξη οξυγόνου κατά την διεξαγωγή του πειράματος μπορούν να παρεμποδίσουν την δράση του ενζύμου. Συμπληρωματικές δοκιμές πραγματοποιήθηκαν στο ηλεκτρόδιο ανθρακονημάτων με την μέθοδο FTaCV η οποία δεν έδωσε κανένα θετικό αποτέλεσμα ούτε για το ένζυμο αλλά ούτε για το φεροκένιο και το σιδηρικυανιούχο κάλιο που χρησιμοποιήθηκαν ως πρότυπα. Συμπεραίνεται ότι το ένζυμο T thLPMO9G λόγω της επιφανειακής δομής του ενεργού κέντρου του είναι ιδιαίτερα ευαίσθητο όσον αφορά την χρήση του σαν ακινητοποιημένο είδος πάνω σε υποστρώματα από άνθρακα. Παρά τις θετικές ενδείξεις που βρέθηκαν τόσο σε ηλεκτρόδιο από χημικά τροποποιημένη τσόχα άνθρακα όσο και σε ηλεκτρόδια δέσμης ανθρακονημάτων, είναι απαραίτητη η περεταίρω ηλεκτροχημική μελέτη και η παραμετροποίηση όλων των συνθηκών του προβλήματος.	el
heal.advisorName	Καραντώνης, Αντώνης	el
heal.committeeMemberName	Mamma, Diomi	en
heal.committeeMemberName	Topakas, Evangelos	en
heal.committeeMemberName	Karantonis, Antonis	en
heal.academicPublisher	Εθνικό Μετσόβιο Πολυτεχνείο. Σχολή Χημικών Μηχανικών. Τομέας Επιστήμης και Τεχνικής των Υλικών (ΙΙΙ)	el
heal.academicPublisherID	ntua
heal.numberOfPages	97 σ.	el
heal.fullTextAvailability	false