Ανακάλυψη Νέων Λυτικών Μονοoξυγενασών των Πολυσακχαριτών και η Εφαρμογή τους στην Παραγωγή Νανοκυτταρίνης από την Υπολειμματική Φυτική Βιομάζα

Χοροζιάν, Κοχάρ Κορίν; Chorozian, Koar

dc.contributor.author	Χοροζιάν, Κοχάρ Κορίν	el
dc.contributor.author	Chorozian, Koar
dc.date.accessioned	2024-09-23T08:04:04Z
dc.identifier.uri	https://dspace.lib.ntua.gr/xmlui/handle/123456789/60241
dc.identifier.uri	http://dx.doi.org/10.26240/heal.ntua.27937
dc.rights	Default License
dc.subject	Βιοτεχνολογία	el
dc.subject	Ενζυμολογία	el
dc.subject	Φυτική Βιομάζα	el
dc.subject	Οξειδωτικά ένζυμα	el
dc.subject	Νανοκυτταρίνη	el
dc.subject	Biotechnology	en
dc.subject	Enzymology	en
dc.subject	Plant Biomass	en
dc.subject	Oxidoreductases	en
dc.subject	Nanocellulose	en
dc.title	Ανακάλυψη Νέων Λυτικών Μονοoξυγενασών των Πολυσακχαριτών και η Εφαρμογή τους στην Παραγωγή Νανοκυτταρίνης από την Υπολειμματική Φυτική Βιομάζα	el
dc.title	Discovery of Novel Lytic Polysaccharide Monoοxygenases and Their Application in Nanocellulose Production from Residual Plant Biomass	el
dc.contributor.department	Τομέας IV, Εργαστήριο Βιοτεχνολογίας	el
heal.type	doctoralThesis
heal.generalDescription	Η παρούσα διατριβή αφορά τη μελέτη με τίτλο «Ανακάλυψη Νέων Λυτικών Μονοoξυγενασών των Πολυσακχαριτών και η Εφαρμογή τους στην Παραγωγή Νανοκυτταρίνης από την Υπολειμματική Φυτική Βιομάζα». Ένας από τους σημαντικότερους στόχους της βιώσιμης οικονομίας είναι η αξιοποίηση των φυσικά διαθέσιμων πολυμερών όπως είναι η φυτική βιομάζα, προς την αξιοποίησή τους για παραγωγή χημικών και καυσίμων. Η λιγνινοκυτταρινούχος βιομάζα, είναι η υπολειμματική βιομάζα που δεν αξιοποιείται από την βιομηχανία τροφίμων και περιλαμβάνει δασικά αγροτικά παραπροϊόντα . Η αξιοποίηση αυτής μπορεί να γίνει με χημική και μηχανική επεξεργασία. Ο πλέον οικολογικός και φιλικός προς το περιβάλλον τρόπος αξιοποίησης της άφθονης υπολλειματικής φυτικής βιομάζας , είναι η ενζυμική κατεργασία. Αυτό σημαίνει αξιοποίηση ενζύμων για την βιομετατροπή της λιγνινοκυτταρινούχου βιομάζας προς την παραγωγή ενέργειας, χημικών και προϊόντων υψηλής προστιθέμενης αξίας. Η μελέτη και η ενίσχυση της επιστήμης της ενζυμολογίας και της ενζυμικής βιοτεχνολογίας είναι ύψιστης σημασίας, καθώς πολλά πεδία παραμένουν ακόμη ανεξερεύνητα. Σε συνδυασμό με την τεχνολογική ανάπτυξη των βιοεπιστημών, της γενετικής μηχανικής, της πρωτεϊνικής μηχανικής και πλέον της τεχνητής νοημοσύνης, ο κλάδος αυτός ακμάζει ραγδαία. Ποια είναι τα καταλληλότερα ένζυμα για την συμμετοχή σε αυτή την κατεργασία; Ένζυμα που στη φύση έχουν την ικανότητα να αποικοδομούν τη φυτική βιομάζα είναι ο στόχος των ενζυμολόγων για να μελετήσουν και να αναλύσουν τις ιδιότητές τους. Στη φύση οι αποικοδομητές της συνολικής φυτικής βιομάζας είναι κυρίως μύκητες αλλά και βακτήρια. Αυτοί οι μικροοργανισμοί περιλαμβάνουν ένα σύνολο ενζύμων με δυνατότητα βιοαποικοδόμησης της οργανικής βιομάζας και τελική βιομετατροπή σε διοξείδιο του ανθράκα. Οι μηχανισμοί που κατέχουν οι μικροοργανισμοί που είναι προσαρμοσμένοι σε απαιτητικές συνθήκες για να μεταβολίζουν τη φυτική βιομάζα, περιλαμβάνουν ένζυμα με εντυπωσιακές ιδιότητες. Η πολύπλοκη δομή των πολυμερών της φυτικής βιομάζας είναι κρίσιμο να έχει κατανοηθεί καθώς αντικατοπτρίζει την πολυπλοκότητα των ενζύμικών μηχανισμών που απαιτούνται για την διάσπασή της. Σημαντική λοιπόν είναι η κατανόηση της δομής της λιγνινοκυτταρινούχου βιομάζας καθώς αποτελείται από ανθεκτικά πολυμερή. Στο πρώτο κεφάλαιο της διατριβής, δηλαδή στη βιβλιογραφική ανασκόπηση, και πιο συγκεκριμένα στην παράγραφο 1.1, παρουσιάζεται η πολύπλοκη δομή των πολυμερών αρχικά της κυτταρίνης, επειτα της ημικυτταρίνης και τέλος της λιγνίνης που απαρτίζουν το σύνθετο φυτικό κυτταρικό τοιχώμα. Στη συνέχεια, η παράγραφος 1.2 παρουσιάζει τον τρόπο με τον οποίο κάθε κατηγορία ενζύμου έχει την ικανότητα να αποπολυμερίζει τα σύνθετα πολυμερή. Τα ένζυμα υπό συζήτηση είναι τα ένζυμα της βάσης δεδομένων Carbohydrate Active enZymes (CAZy), δηλαδή τα ένζυμα που έχουν δράση σε πολυσακχαρίτες, και είναι κατηγοριοποιημένα σύμφωνα με την αμινοξική αλληλουχία τους, και την ικανότητά τους να δρουν σε πολυσακχαρικά υποστρώματα. Τα υποκεφάλαια 1.2.1 και 1.2.2 αναλύουν τα υδρολυτικά ένζυμα, δηλαδή τις κυτταρινάσες και τις ημικυτταρινάσες αντίστοιχα, που συμμετέχουν με επιτυχία στον αποπολυμερισμό κυτταρίνης και ημικυτταρίνης και χρησιμοποιούνται σε βιομηχανική κλίμακα για αυτόν τον σκοπό με αξιοσημείωτες αποδόσεις. Τις προηγούμενες δεκαετίες, στόχος της ενζυμικής βιοτεχνολογίας ήταν η σακχαροποίηση της λιγνοκυτταρινούχου βιομάζας το οποίο επιτευχθεί σε ικανοποιητικό βαθμό. Ωστόσο, η κρυσταλλική κυτταρίνη καθώς και η λιγνίνη αποτελούν τις δύο κατηγορίες πολυμερών που δεν έχει επιτευχθεί η πλήρως και βιώσιμα η ενζυμική αποικοδόμησή τους. Για αυτές τις κατηγορίες, η φύση διαθέτει κυρίως οξειδοαναγωγικά ένζυμα που μπορούν με αντιδράσεις οξείδωσης να διασπούν ακόμη και τους πιο απρόσιτους γλυκοσιδικούς δεσμούς ή και το σύνθετο πλέγμα λιγνίνης. Η παράγραφος 1.1.3 παρουσιάζει τα λιγνινολυτικά οξειδωτικά ένζυμα. Τα καινοτόμα οξειδωτικά ένζυμα που συμμετέχουν στον αποπολυμερισμό δυσπρόσιτων πολυμερών όπως η κρυσταλλική κυτταρίνη ονομάζονται λυτικές μονοοξυγενάσες των πολυσακχαριτών (Lytic Polysaccharide Monooxygenases, LPMOs) και έχουν προσελκύσει το ενδιαφέρον της επιστημονικής κοινότητας, καθώς μπορούν να διασπούν τους γλυκοζιτικούς δεσμούς με οξειδωτικό τρόπο. Τα ένζυμα αυτά αποτέλεσαν το κύριο αντικείμενο μελέτης αυτής της διατριβής και αναλύονται στο υποκεφάλαιο 1.3. Συνολικά, τα ένζυμα που συμμετέχουν στην αποικοδόμηση της λιγνοκυτταρινούχου βιομάζας χρησιμοποιούνται στη βιομηχανία σε συνδυασμούς, καθώς και στη φύση πολυσυστήματα ενζύμων απαρτίζουν τα μεταβολικά μονοπάτια που χρησιμοποιούν οι μικροοργανισμοί για αυτήν την πολύπλοκη και απαιτητική διεργασία. Έτσι, στην παράγραφο 1.2.4 παρουσιάζεται ο τρόπος που συνδυάζονται και συντονίζονται τα ένζυμα σε διάφορους μελετημένους οργανισμούς, κυρίως μέσω μελέτης γονιδιωματικής, μεταγραφωμικής και πρωτεωμικής ανάλυσης. Τα οξειδωτικά ενζυμικά συστήματα έχει προταθεί ότι μπορούν, πέρα από τις αντιδράσεις οξείδωσης που εκτελούν στο εκάστοτε υπόστρωμα, να λειτουργούν και ως ρυθμιστικοί παράγοντες του μεταβολισμού της συνολικής διαδικασίας λιγνοκυτταρινούχου αποικοδόμησης. Στο υποκεφάλαιο 1.3 παρουσιάζεται η βιβλιογραφική ανασκόπηση για τις λυτικές μονοοξυγενάσες των πολυσακχαριτών. Οι LPMOs έχουν προσφέρει μία νέα προοπτική για το πώς η φύση διασπά πολυμερή όπως η κυτταρίνη και η χιτίνη, μεταξύ άλλων φυσικών πολυσακχαριτών. Σε αντίθεση με τα υδρολυτικά ένζυμα που αλληλεπιδρούν με μεμονωμένες αλυσίδες κυτταρίνης, οι LPMOs μπορούν να διασπούν αλυσίδες ακόμη και στις πιο κρυσταλλικές τους περιοχές. Οι LPMOs ενεργοποιούν τους γλυκοζιτικούς δεσμούς υδροξυλιώνοντας το πολυσακχαριτικό υπόστρωμα είτε στον άνθρακα C1 είτε στον C4. Η ενεργοποίηση των δεσμών C–H και η διάσπαση των γλυκοζιτικών δεσμών στους πολυσακχαρίτες απαιτούν ισχυρή οξειδοαναγωγική ενέργεια για να ξεπεραστεί ένα φράγμα ενεργοποίησης περίπου 95 kcal/mol. Οι LPMOs ταξινομούνται προς το παρόν σε οκτώ οικογένειες επικουρικής δραστηριότητας (auxiliary activity, AA) (AA9-11,13-17) στη βάση δεδομένων CAZy. Η επικουρική δράση των LPMOs οφείλεται στα ισχυρά συνεργηστικά φαινόμενα που παρουσιάζουν τα ένζυμα αυτά με τα υδρολυτικά. Οι LPMOs είναι μεταλλοένζυμα με χαλκό που συντονίζεται από δύο συντηρημένα αμινοξικά κατάλοιπα ιστιδίνών που αποτελούν το ενεργό κέντρο των ενζύμων. Η διάσπαση της αλυσίδας πολυσακχαριτών από τις LPMOs λαμβάνει χώρα με την παροχή ενός μορίου οξυγόνου που προέρχεται είτε από το μοριακό οξυγόνο, είτε το υπεροξείδιο. Για αυτό τον λόγο ονομάζονται μονοοξυγενάσες καθώς και περοξυγενάσες. Παρόλο που οι συζητήσεις σχετικά με τη φύση του συν-υποστρώματος παραμένουν ανοιχτές στην επιστημονική κοινότητα, είναι κοινά αποδεκτό ότι οι LPMOs οξειδώνουν τους γλυκοζιτικούς δεσμούς μέσω μιας δομής στο ενεργό τους κέντρο που περιλαμβάνει ισχυρά δραστική δομή του Cu (II) -O•-. Η καταλυτική διαδικασία ξεκινά με την παροχή ενός ηλεκτονίου από έναν εξωτερικό δότη, που μπορεί να αποτελεί ένα μικρό οργανικό μόριο, όπως το ασκορβικό οξύ. Επιπλέον οι LPMOs έχουν δράση περοξειδάσης και οξειδάσης, παρουσία ενός κατάλληλου δότη ηλεκτρονίων και O2, και απουσία του πολυσακχαριτικού υποστρώματος. Η αποκάλυψη της επίπτωσης των υψηλών συγκεντρώσεων H2O2 στη σταθερότητα των LPMOs, η οποία μπορεί να απενεργοποιήσει το ένζυμο, προσθέτει μια νέα διάσταση στην πολυπλοκότητα των αντιδράσεων των LPMOs. Έτσι, όταν εξετάζονται οι LPMOs, είναι απαραίτητο να αξιολογηθεί η σχέση τους με το H2O2. Στα υποκεφάλαια 1.3.1 έως 1.3.6, παρουσιάζεται η ταξινόμηση των οικογενειών των LPMOs, ο ρόλος τους στην παθογένεια, η αλληλεπίδραση των ενζύμων με τα υποστρώματά τους, ο μηχανισμός δράσης τους, η σχέση τους με τους δότες ηλεκτρονίων, καθώς και η δομική και λειτουργική ετερογένεια των LPMOs. Τα νέα ένζυμα των LPMOs έχουν βρει εφαρμογή στη βιομηχανία ως συστατικά ενζυμικών κοκτέιλς που χρησιμοποιούνται στη βιοαποικοδόμηση της λιγνινοκυτταρινούχου βιομάζας. Στα επόμενα χρόνια προβλέπεται να αποτελέσουν αξιοποιήσιμα ένζυμα σε ποικίλες εφαρμογές λόγω της ισχυρής οξειδωτικής τους ικανότητας. Τα τελευταία χρόνια, μια νέα εφαρμογή των LPMOs έχει αρχίσει να αναπτύσσεται, η οποία αφορά τη συμμετοχή των ενζύμων αυτών στην παραγωγή νανοκυτταρίνης. Λόγω πολλαπλών περιβαλλοντικών ανησυχιών σχετικά με τη χρήση μη ανανεώσιμων ορυκτών πόρων, υπάρχει αυξανόμενο ενδιαφέρον για τη βιώσιμη παραγωγή υλικών και χημικών από λιγνοκυτταρινική βιομάζα. Η μετάβαση σε μια βιώσιμη κυκλική βιοοικονομία έχει καταστήσει απαραίτητη την αναζήτηση καινοτόμων εναλλακτικών για την ανάπτυξη νέων βιώσιμων και βιοαποικοδομήσημων προϊόντων. Ένα από αυτά τα προϊόντα είναι η νανοκυτταρίνη, σε μορφή κρυστάλλων ή νανοϊνών κυτταρίνης, με τουλάχιστον μία διάσταση στη νανοκλίμακα (1–100 nm). Χρησιμοποιείται σε μια ποικιλία εφαρμογών λόγω των μοναδικών της χαρακτηριστικών όπως η υψηλή μηχανική αντοχή και οι αντιμικροβιακές λειτουργίες. Η νανοκυττάρινη μπορεί να απομονωθεί από διάφορες πηγές κυτταρίνης, συμπεριλαμβανομένου του τοιχώματος της φυτικής βιομάζας, και στην παρούσα διατριβή αναπτύχθηκαν μεθοδολογίες βασισμένες στα ένζυμα LPMOs, που στοχεύουν στην απομόνωση νανοκυτταρίνης από την λιγνοκυτταρινούχα βιομάζα. Η ενζυμική προσέγγιση για την απομόνωση νανοκυτταρίνης από λιγνινοκυτταρινούχο βιομάζα, καθώς και η χρήση των LPMOs για αυτόν τον σκοπό, παρουσιάζονται στο υποκεφάλαιο 1.4. Στη συνέχεια, το κεφάλαιο 2 αφορά τις μεθόδους και τα υλικά που χρησιμοποιήθηκαν στο πειραματικό μέρος της παρούσας διατριβής. Αναφέρονται τα πειραματικά πρωτόκολλα για την επιλογή των ετερόλογων πρωτεϊνών, η κλωνοποίηση των γονιδίων, η ετερόλογη έκφραση και η απομόνωση τους. Επιπλέον, παρουσιάζονται ο βιοχημικός χαρακτηρισμός, η βιοπληροφορική μελέτη και η οπτικοποίηση των δομών. Η ανάλυση της δραστηριότητας των LPMOs ως περοξυγενάσες, μονοοξυγενάσες και οξειδάσες και περοξειδάσες περιγράφεται λεπτομερώς. Η πρωτεινική μηχανική και η έκφραση μεταλλάξεων στις δομές των υπο μελέτη πρωτεινών περιγράφεται στο κεφάλαιο αυτό. Στη συνέχεια περιγράφονται οι αναλυτικές μέθοδοι ταυτοποιήσης των διαλυτών προϊόντων των αντιδράσεων με τη χρήση χρωματογραφίας υψηλής απόδοσης ιόντο-ανταλλαγής συνδεδεμένης με αμπερομετρικό ανιχνευτή παλμού. Εξετάστηκε η πρόσδεση των LPMOs με πολυσακχαρίτες κυτταρίνης και ημικυτταρίνης. Τέλος περιγράφεται η κατεργασία που αναπτύχθηκες στα πλαίσια της παρούσας διατριβής για την απομόνωση νανοκυτταρίνης από υπολλειματικη φυτική βιομάζα, καθώς οι αναλυτικές μέθοδοι καθώς και οι μέθοδοι μικροσκοπίας που εφαρμόστηκαν για τον χαρακτηρισμό της ποιότητας της παραχθείσας νανοκυτταρίνης. Τα αποτελέσματα και η συζήτηση της παρούσας διατριβής παρουσιάζονται στο κεφάλαιο 3. Τα αποτελέσματα έχουν διαρθρωθεί σε τρία βασικά υποκεφάλαια, ακολουθώντας τη δομή των εργασιών που έχουν οδηγήσει σε δημοσιεύσεις άρθρων σε επιστημονικά περιοδικά. Η πρώτη εργασία, που παρουσιάζεται στην παράγραφο 3.1, αναφέρεται στην ετερόλογη έκφραση και απομόνωση ενός ενζύμου LPMO από την οικογένεια AA9, το οποίο προέρχεται από τον μύκητα Thermothelomyces thermophilus και ονομάζεται TthLPMO9G. Σε αυτή τη εργασία μελετήθηκε η ενεργότητα του TthLPMO9G κατά την οξείδωση της κυτταρίνης παρουσια διαφορετικών δοτών ηλεκτρονιων. Παράλληλα, διερευνήθηκε η ενζυμική αυτο-οξείδωση που λαμβάνει χώρα στα ένζυμα και προκαλεί την απενεργοποίησή τους παρουσία υψηλών συγκεντρώσεων υπεροξειδίου, το οποίο παράγεται τόσο από το ίδιο το ένζυμο όσο και ανεξάρτητα από τους δότες ηλεκτρονίων. Η προσθήκη ενζύμου καταλάσης απομακρύνει το ενδεχόμενο συσσώρευσης υπεροξειδίου, και αυτή η προσέγγιση επιτρέπει μια πιο σαφή κατανόηση της αποδοτικότητας κάθε δότη ηλεκτρονίων χωρίς την παρέμβαση του H2O2 που παράγεται από τους δότες. Στη παρούσα εργασία εξετάστηκαν οι αλληλεπιδράσεις εντός του πρώτου και του δεύτερου χώρου συντονισμού του ενεργού χώρου των αμινοξέων, μέσω αμινοξικών αντικαταστάσεων του TthLPMO9G που πραγματοποιήθηκαν με τη χρήση πρωτεϊνικής μηχανικής δηλαδή των H140A και S28A. Τα μεταλλάγματα αυτά παράλληλα με τον άγριο τύπο αξιολογήθηκαν για την δράση μονοοξυγενάσης/περοξυγενάσης, οξειδάσης και περοξιδάσης. Τα αποτελέσματα που προέκυψαν από αυτή τη μελέτη υπέδειξαν νέες συσχετίσεις μεταξύ του ένζυμου, των δοτών ηλεκτρονίων, του H2O2, και του υποστρώματος κυτταρίνης. Σε άλλο στάδιο της διατριβής που παρουσιαζεται στο υποκεφαλαιο 3.2 εστιάζεται σε μια άλλη οικογένεια LPMO, την AA16. Οι πιο πρόσφατες περιγραφές οικογενειών είναι η αινιγματική οικογένεια AA16, που προέρχεται από μύκητες και οομύκητες, και η οικογένεια AA17 που είναι κυρίως παρούσα σε οομύκητες και αποτελείται από ένζυμα με δραστηριότητα στην πηκτίνη. Η ανακάλυψη της οικογένειας AA16 LPMO μέσω της πρωτεομικής ανάλυσης άνοιξε νέους δρόμους στον ερευνητικό τομέα των ενζύμων που αποικοδομούν την φυτική βιομάζα. Το πρώτο ετερολογα παραγόμενο και χαρακτηρισμένο ένζυμο αναφέρθηκε το 2019, από τον Aspergillus aculeatus. Αυτό το ένζυμο φάνηκε να λειτουργεί μέσω ενός μηχανισμού οξειδωτικής διάσπασης της κυτταρίνης. Επίσης αποδείχτηκε η επικουρική δράση του σε υδρολυτικά ένζυμα. Επιπλέον, επιβεβαιώθηκε η ικανότητα του να παράγει H2O2 απουσία υποστρώματος. Συνεχίζοντας, δύο νέα μέλη της οικογένειας AA16 έχουν πρόσφατα χαρακτηριστεί το 2023, που δεν φαίνεται να εμφανίζουν δράση σε πολυσακχαρικά υποστρώματα. Αντίθετα, λειτουργούν ως οξειδάσες και επιπλέον ενισχύουν τη δραστηριότητα άλλων LPMOs από την οικογένεια AA9 επιδεικνύοντας σημαντικά συνεργιστικά φαινόμενα. Παράλληλα με τις δύο μοναδικές μελέτες που υπάρχουν για την οικογένεια ΑΑ16, ήταν υπό εξέλιξη η δική μας έρευνα, όπως παρουσιάζεται στο υποκεφάλαιο 3.2. Κατά συνέπεια, η παρούσα διατριβή συνιστά θεμελιώδη βάση στη μελέτη αυτής της οικογένειας και αποτελεί μία από τις πρώτες που ασχολήθηκαν με ένζυμα ΑΑ16, τα οποία και εμφανίζουν σημαντική ετερογένεια. Πραγματοποιήθηκε η ετερόλογη έκφραση και ο βιοχημικός χαρακτηρισμός του TtLPMO16A, από τον θερμόφιλο μύκητα Thermothelomyces thermophilus. Τα αποτελέσματα υποδεικνύουν σημαντική οξειδωτική δράση στην ημικυτταρίνη, αλλά όχι στην κυτταρίνη. Εξετάστηκε η δράση του ενζύμου ως μονοοξυγενάσης / περοξυγενάσης, οξειδάσης και περοξειδάσης. Εξετάστηκε το ενδεχόμενο πρόσδεσης του ενζύμου σε πολυσακχαρικό υπόστρωμα ξυλάνης, και μελετήθηκε η δράση του TtLPMO16A στην ενίσχυση της δράσης ενζύμων από την οικογένεια ΑΑ9. Στο τρίτο μέρος των αποτελεσμάτων της παρούσας διατριβής, περιγράφεται η εργασία που διεξήχθη με τη χρήση LPMOs για την παραγωγή νανοκυτταρίνης, όπως αναφέρεται στην παράγραφο 3.3. Βελτιστοποιήθηκε η ικανότητά των LPMOs να δρουν σε συνδυασμό με κυτταρίνασες και ημικυτταρινάσες για την απομόνωση νανοκυτταρίνης από βιομάζα ξύλου οξιάς με τελικό στόχο υψηλής ποιότητας νανοκυτταρίνη. Η διεργασία που αναπτύχθηκε συμπεριέλαβε τις LPMOs τόσο ως πρώτο ενζυμικό βήμα, δηλαδή πριν από την αφαίρεση της ημικυτταρίνης και της κυτταρίνης, όσο και τελικό βήμα για την παραγωγή λειτουργικής νανοκυτταρίνης μέσω της αύξησης του αριθμού των καρβοξυλικών ομάδων, αυξάνοντας τις απωστικές δυνάμεις μεταξύ των ινών, σταθεροποιώντας το τελικό κολλοειδές υλικό. Ορίστηκε η μορφολογία και οι ιδιότητες των νανοπροϊόντων, αποκαλύπτοντας νέες προοπτικές στο ρόλο των LPMOs. Τα αποτελέσματα οδήγησαν στο συμπέρασμα ότι οι LPMOs προωθούν την αμορφογένεση της υπολλειματικής φυτικής βιομάζας με τρόπο που στοχεύει όχι μόνο η κυτταρίνη αλλά και η ημικυτταρίνη. Στο κεφάλαιο 4, παρουσιάζονται τα γενικά συμπεράσματα της διατριβής και καθορίζονται οι μελλοντικοί στόχοι, τονίζοντας την ανάγκη για εμβάθυνση στις δυναμικές αλληλεπιδράσεις μεταξύ ενζύμων της οικογένειας AA9, υποστρωμάτων, οξυγόνου, υπεροξειδίου και δοτών ηλεκτρονίων. Επισημαίνεται η αναγκαιότητα λειτουργικού χαρακτηρισμού και άλλων μελών της οικογένειας AA16 ώστε να αποκαλυφθεί η βιοτεχνολογική δυναμική τους. Παρά τις προκλήσεις, η παρούσα διατριβή κάλυψε ένα χάσμα γνώσης και επισήμανε την πρακτική εφαρμογή σε χρήσιμες βιοτεχνολογικές εφαρμογές, όπως η παραγωγή νανοκυτταρίνης. Τέλος, στο κεφάλαιο 5 αναφέρεται η βιβλιογραφία που μελετηθηκε και χρησιμοποιήθηκε στα πλαίσια της παρούσας διατριβής.	el
heal.classification	Βιοτεχνολογία	el
heal.classification	Biotechnology	en
heal.dateAvailable	2025-09-22T21:00:00Z
heal.language	en
heal.access	embargo
heal.recordProvider	ntua	el
heal.publicationDate	2024-02-09
heal.abstract	Η παρούσα διατριβή εστίασε στην μελέτη των λυτικών μονοoξυγενασών των πολυσακχαριτών (LPMOs), μίας κατηγορίας μεταλλοενζύμων που συμμετέχουν στην οξειδωτική διάσπαση της φυτικής βιομάζας και την εφαρμογή αυτών στην απομόνωση νανοκυτταρίνης από την υπολλειμματική φυτική βιομάζα. Αρχικά, η έρευνα εστίασε στην ετερόλογη έκφραση και βιοχημική ανάλυση νέων LPMOs, με έμφαση στις οικογένειες AA9 και AA16, της βάσης δεδομένων CAZy που περιλαμβάνει όλα τα ένζυμα που δρουν στους υδατάνθρακες. Τα ένζυμα που επιλέχτηκαν, προέρχονται από το θερμόφιλο μύκητα Thermothelomyces thermophilus και ονομάστηκαν TthLPMO9G και TtLPMO16A, αντίστοιχα. Ύστερα από τον βιοχημικό χαρακτηρισμό τους, αποκαλύφθηκε ότι διαθέτουν την ικανότητα να αναγνωρίζουν υποστρώματα κυτταρίνης και της ημικυτταρίνης και να πραγματοποιούν την οξειδωτική διάσπαση τους. Συγκεκριμένα για την οικογένεια ΑΑ16, αποκαλύφθηκε η ικανότητα οξειδωτικής διάσπασης σε υποστρώματα ξυλάνης, κάτι που αναφέρεται για πρώτη φορά στην βιβλιογραφία. Η έρευνα εμβάθυνε στην κατανόηση των ενεργοτήτων των LPMOs, συμπεριλαμβανομένων των λειτουργιών μονοoξυγενάσης / περοξυγενάσης, περοξειδάσης και οξειδάσης, ενισχύοντας τη γνώση για αυτά τα ένζυμα στο ευρύτερο πλαίσιο των οξειδοαναγωγικών ενζύμων. Επιπλέον, μέσω πρωτεινικής μηχανικής και σημειακών μεταλλάξεων αποκάλύφθηκαν νέες πληροφορίες σχετικά με τις αλληλεπιδράσεις του ενεργού κέντρου με το υποστρώμα του πολυσακχαρίτη καθώς και με το υπεροξείδιο και τους δότες ηλεκτρονίων. Στη συνέχεια μελετήθηκε η εφαρμογή των LPMOs στην παραγωγή νανοκυτταρίνης από προκατεργασμένη φυτική βιομάζα, όπου αποκαλύφθηκε ότι η μεσολάβηση μίας ενζυμική διεργασίας μπορεί να παρακάμψει την ανάγκη για συμβατικές μηχανικές ή χημικές διεργασίες. Η νανοκυτταρίνη, ένα βιο-πολυμερές υψηλής προστιθέμενης αξίας, δύναται να αντικαταστήσει τα πετροχημικά στην βιομηχανία πλαστικών. Η χρήση των LPMOs σε συνδυασμό με άλλα υδρολυτικά ένζυμα έχει αξιοποιηθεί για την παραγωγή νανοκυτταρίνης υψηλής ποιότητας. Συνοψίζοντας, αυτή η διατριβή συμβάλλει στη βασική κατανόηση της δράσης των LPMOs και έχει προάγει την εφαρμογή νέων τεχνολογιών στη βιώσιμη επιστήμη υλικών. Η προσθήκη οξειδωτικών ένζύμων όπως οι LPMOs σε εμπορικά μείγματα που ηδη αξιοποιούνται στη βιομηχανία, είναι σημαντική για την ανάπτυξη διεργασιών που στοχεύουν στην αξιοποίηση της φυτικής βιομάζας, σηματοδοτώντας ένα σημαντικό βήμα προς τη μετάβαση στη βιώσιμη βιοοικονομία.	el
heal.abstract	This thesis investigates the role of lytic polysaccharide monooxygenases (LPMOs), a unique class of copper-dependent enzymes essential for the enzymatic breakdown of plant biomass, and their role in the production of nanocellulose. The study begins with the expression and biochemical characterization of novel LPMOs from the AA9 and AA16 families, identified within the CAZy database. These enzymes, sourced from Thermothelomyces thermophilus and designated as TthLPMO9G and TtLPMO16A respectively, display novel activities that facilitate the oxidative cleavage of cellulose and hemicellulose. Experiments in this study has enhanced the understanding of LPMOs' activities, including monoxygenase/peroxygenase, peroxidase, and oxidase functions within the oxidoreductase enzyme group. The AA16 family, a newly identified group of enzymes, has been found to possess a unique oxidative activity on xylan substrates. This discovery is notable as it represents a novel capability that has not been previously documented in the literature. Additionally, LPMO protein engineering through single point mutations has provided insights into the active site interaction with electron donors, hydrogen peroxide and polysaccharides. The application of LPMOs for nanocellulose production has been also demonstrated, indicating that LPMO utillization on residual plant material can eliminate the need for traditional mechanical or chemical processing steps. Nanocellulose, a high-value biomaterial, is emerging as a potential base polymer that can replace petroleum-based plastic materials.The synergistic use of LPMOs with cellulolytic and hemicellulolytic enzymes produces high-quality, well-dispersed nanocellulose from pretreated residual plant biomass. In conclusion, this thesis contributes to the basic understanding of LPMO functions and sets the stage for their use in sustainable material science applications. The effects of LPMOs and other enzymes are suggested as a foundation for future industrial processes that valorize plant biomass, an important shift toward a sustainable bio-economy.	en
heal.sponsor	Η παρούσα διδακτορική έρευνα συγχρηματοδοτήθηκε από την ευρωπαϊκή ένωση (ΕΕ) και από εθνικούς πόρους μέσω του επιχειρησιακού προγράμματος "Ενιαία Δράση Κρατικών Ενισχύσεων Έρευνας, Τεχνολογικής Ανάπτυξης & Καινοτομίας - Ερευνώ-Δημιουργώ-Καινοτομώ Β’ Κύκλος" του ΕΣΠΑ, με κωδικό έργου: Τ2ΕΔΚ-00468 και τίτλο έργου: "Αξιοποίηση Αγροτικών Παραπροϊόντων με Μετατροπή σε Αλληλουχία Βιο- και Θερμο- Χημικά προς Πρόσθετα Τροφίμων Υψηλής Αξίας". Επιπρόσθετα, η έρευνα υποστηρίχθηκε από το πρόγραμμα ΕΛΙΔΕΚ "ECHEM-4-LPMO: Ηλεκτροχημική Ανάλυση της Δράσης Λυτικών Πολυσακχαρικών Μονοοξυγενάσων", με κωδικό ΕΛΙΔΕΚ 3090, που εγκρίθηκε στο πλαίσιο της "1ης Προκήρυξης Ερευνητικών Έργων ΕΛ.ΙΔ.Ε.Κ. για την ενίσχυση Μελών ΔΕΠ και Ερευνητών". Τέλος, η έρευνα υποστηρίχθηκε με υποτροφία από τα διαθέσιμα κονδύλια του Ειδικού Λογαριασμού Έρευνας (ΕΛΚΕ) του ΕΜΠ, σύμφωνα με τον Κανονισμό Υποτροφιών του ΕΛΚΕ ΕΜΠ 05-09-2018.	el
heal.advisorName	Topakas, Evangelos
heal.advisorName	Τόπακας, Ευάγγελος	el
heal.committeeMemberName	Topakas, Evangelos	en
heal.committeeMemberName	Dimarogona, Maria	en
heal.committeeMemberName	Karnaouri, Anthi	en
heal.committeeMemberName	Karantonis, Antonis	en
heal.committeeMemberName	Zerva, Anastasia	en
heal.committeeMemberName	Vouyiouka, Stamatina	en
heal.committeeMemberName	Mamma, Diomi	en
heal.committeeMemberName	Τόπακας, Ευάγγελος	el
heal.committeeMemberName	Δημαρόγωνα, Μαρία	el
heal.committeeMemberName	Καρναούρη, Ανθή	el
heal.committeeMemberName	Καραντώνης, Αντώνιος	el
heal.committeeMemberName	Ζερβα, Αναστασία	el
heal.committeeMemberName	Βουγιούκα, Σταματίνα	el
heal.committeeMemberName	Μάμμα, Διώνη	el
heal.committeeMemberName
heal.committeeMemberName
heal.committeeMemberName
heal.committeeMemberName
heal.committeeMemberName
heal.academicPublisher	Εθνικό Μετσόβιο Πολυτεχνείο. Σχολή Χημικών Μηχανικών	el
heal.academicPublisherID	ntua
heal.numberOfPages	189 p.	el
heal.fullTextAvailability	false