Χρήση μοριακών εργαλείων για τη μελέτη της καταλυτικής εξειδίκευσης των εστερασών του φερουλικού οξέος

Abstract

Στην παρούσα διδακτορική διατριβή μελετήθηκαν τόσο σε μοριακό όσο και σε βιοχημικό επίπεδο δύο εστεράσες του φερουλικού οξέος των ημικυτταρινών από δύο ευκαρυωτικούς μικροοργανισμούς, το μεσόφιλο μύκητα Fusarium oxysporum και το θερμόφιλο μύκητα Sporotrichum thermophile. Αρχικά, πραγματοποιήθηκε in silico ανάλυση των γονιδιωμάτων των παραπάνω μικροοργανισμών και στη συνέχεια των αλληλουχιών των εστερασών του φερουλικού οξέος που συναντώνται σε αυτούς. Οι αλληλουχίες δύο γονιδίων που κωδικοποιούν για εστεράσες του φερουλικού οξέος απομονώθηκαν και πολλαπλασιάστηκαν με τη βοήθεια αλυσιδωτής αντίδρασης πολυμεράσης και έπειτα κλωνοποιήθηκαν και εκφράστηκαν λειτουργικά μέσω του συστήματος έκφρασης του μεθυλότροφου ζυμομύκητα Pichia pastoris Χ33. Επιπλέον, μελετήθηκαν οι φυσικοχημικές ιδιότητες των ανασυνδυασμένων ενζύμων που παρήχθησαν, FoFaeC και StFaeB. H ίδια διαδικασία ακολουθήθηκε για μια τρίτη ημικυτταρινάση, την ξυλανάση FoXyn11 της οικογένειας 11 των γλυκοζυλ-υδρολασών από το F. oxysporum και επιχειρήθηκε επιτυχώς η ενίσχυση της παραγωγής των ενζύμων FoFaeC και FoXyn11 μέσω βελτιστοποίησης των συνθηκών ζύμωσης του μύκητα P. pastoris. Σε επόμενο στάδιο της διατριβής, κατευθυνόμενες σημειακές μεταλλάξεις στις νουκλεοτιδικές αλληλουχίες των καταλυτικών κέντρων των ενζύμων FoFaeC και StFaeB, οδήγησαν στον εντοπισμό της καταλυτικής σερίνης η οποία μετέχει στο μηχανισμό υδρόλυσης των εστερικών δεσμών, επαληθεύοντας την κατηγοριοποίησή τους στην οικογένεια των εστερασών σερίνης και συγκεκριμένα στην ομάδα των εστερασών του φερουλικού οξέος. Περαιτέρω ανάλυση της αμινοξικής αλληλουχίας της StFaeB, με τη βοήθεια εργαλείων της Bιοπληροφορικής, συνέβαλλε στην πρόβλεψη της τρισδιάστατης δομής της. Ο πλήρης χαρακτηρισμός της εξειδίκευσης υποστρώματος των υπό μελέτη εστερασών του φερουλικού οξέος διενεργήθηκε με τη χρήση διαφόρων συνθετικών και φυσικών υποστρωμάτων, συμπεριλαμβανομένων των κινναμικών μεθυλεστέρων, των αλκυλ-εστέρων του φερουλικού οξέος και των π-νιτροφαινυλ-αραβινοφουρανοζιτών. Τα αποτελέσματα των πειραμάτων αυτών οδήγησαν στην κατηγοριοποίηση των εστερασών FoFaeC και StFaeB στις ομάδες C και Β, αντίστοιχα, σύμφωνα με βιβλιογραφικά δεδομένα, ενώ η σύγκριση των αμινοξικών τους αλληλουχιών με αλληλουχίες γνωστών από τη βιβλιογραφία εστερασών του φερουλικού οξέος, επέτρεψαν την κατηγοριοποίηση τους στις υποοικογένειες (Subfamilies) SF1 και SF6 αντίστοιχα. Παράλληλα, τα εν λόγω πρωτεϊνικά μόρια εξετάστηκαν ως προς τις βέλτιστες συνθήκες δράσης τους και τη σταθερότητα που εμφανίζουν σε ένα εύρος τιμών pH και θερμοκρασιών. Στη συνέχεια μελετήθηκε εκτενώς η συνεργιστική δράση μεταξύ των εστερασών του φερουλικού οξέος και των ξυλανασών. Και οι δύο εξεταζόμενες ανασυνδυασμένες εστεράσες, αποδείχθηκε ότι έχουν την ικανότητα να απελευθερώνουν φερουλικό οξύ από λιγνινοκυτταρινούχα υλικά, μόνο με τη βοήθεια ξυλανασών. Η μέγιστη τιμή παραγόμενου - από τα ζεύγη των ενζύμων - φερουλικού οξέος μετρήθηκε κατά τη συνεργιστική δράση της εστεράσης FoFaeC και της εμπορικής ξυλανάσης TlXyn11 από το μύκητα Trichoderma longibrachiatum. Ο συγκεκριμένος συνδυασμός ενζύμων χρησιμοποιήθηκε και σε αντιδράσεις υδρόλυσης του στερεού υπολείμματος βύνης, ενώ περαιτέρω ενίσχυση της απελευθέρωσης φερουλικού οξέος παρατηρήθηκε κατόπιν προσθήκης πολυενζυμικού εκχυλίσματος από το μύκητα F. oxysporum. Τέλος, οι αλληλεπιδράσεις μεταξύ των ανενεργών μορφών των υπό μελέτη εστερασών, οι οποίες δημιουργήθηκαν κατόπιν σημειακής μεταλλαξιγένεσης, και των ολιγοσακχαριτών από αραβινοξυλάνη σίτου, διερευνήθηκαν μέσω Θερμιδομετρίας Ισόθερμης Τιτλοδότησης, με σκοπό την κατανόηση της ποικιλομορφίας των ενζύμων αυτών και του ρόλου τους στην αποικοδόμηση των φυτικών κυτταρικών τοιχωμάτων. Ο φερουλοποιημένος αραβινο-ξυλοτρισακχαρίτης εμφάνισε ισχυρότερη δέσμευση στην εστεράση FoFaeC S217A, ενώ η 1,5-α-L-αραβινοτετραόζη φάνηκε να μην αλληλεπιδρά με τις συγκεκριμένες πρωτεΐνες. Για πρώτη φορά, πραγματοποιήθηκε μια επιτυχημένη προσπάθεια μελέτης και ερμηνείας των μηχανισμών κατάλυσης των εστερασών του φερουλικού οξέος από τους μύκητες F. oxysporum και S. thermophile, με χρήση μοριακών τεχνικών και εργαλείων Bιοπληροφορικής, σηματοδοτώντας έτσι την απαρχή μιας νέας πορείας στην εκμετάλλευση των ενζύμων αυτών στους διάφορους τομείς της βιομηχανίας.

The present PhD thesis focuses on the molecular and biochemical study of the ferulic acid esterases of hemicellulose by two eukaryotic microorganisms, the mesophilic fungus Fusarium oxysporum and the thermophilic fungus Sporotrichum thermophile. An in silico analysis of the microorganism genomes followed by esterase of ferulic acid sequences analysis were held. The sequences of two genes coding for ferulic acid esterases were isolated and amplified using polymerase chain reaction and then cloned and functionally expressed in the expression system of methylotrophic yeast Pichia pastoris X33. Furthermore, the physicochemical properties of the produced recombinant enzymes FoFaeC and StFaeB, were studied. The same procedure was followed using a third hemicellulose, xylanase FoXyn11, member of fungal glycosyl-hydrolase family 11 from F. oxysporum and the production enhancement of the enzymes FoFaeC and FoXyn11 was successfully carried out by optimizing the P. pastoris fermentation conditions. The molecular biology technique site-directed mutagenesis was chosen in order to experimentally prove that the enzymes FoFaeC and StFaeB harbor the catalytic serine and classified in serine esterases family, especially in ferulic acid esterases group. Additional analysis of the amino acid sequence of StFaeB, using several bioinformatics tools, resulted in three-dimensional structure prediction. The complete characterization of ferulic acid esterases hydrolytic profiles was performed using various synthetic and natural substrates, including methyl esters of hydroxycinnamates, alkyl ferulates and monoferuloylated 4-nitrophenyl glycosides. The results of these experiments allowed the classification of the esterases FoFaeC and StFaeB into types C and B, respectively, according to literature, while the comparison of the amino acid sequences of these enzymes with known ferulic acid esterases allowed their categorization into subfamilies SF1 and SF6, respectively. The optimum temperature and pH value of the above enzyme activities and their thermo- and pH-stability were also determined. The synergism of ferulic acid esterases with xylanases was extensively studied. Both of the studied recombinant esterases showed the ability to release ferulic acid from ligninocellulosic materials only with the aid of xylanase. The maximum ferulic acid production was achieved by the synergistic action of esterase FoFaeC with commercial xylanase TlXyn11 by the fungus Trichoderma longibrachiatum. This certain combination of enzymes was used for the hydrolysis of brewers’ spent grain, while further increase of the ferulic acid release was observed after the addition of crude extract from F. oxysporum in the reaction. The synergistic interaction between the inactive forms of the enzymes that were produced after site-directed mutagenesis, and oligosaccharides from wheat arabinoxylan, were investigated using Isothermal Titration Calorimetry, in order to understand the ferulic acid esterases diversity and their role in plant cell wall degradation. The feruloylated oligosaccharide was showed stronger binding affinity to esterase FoFaeC S217A, while 1,5-α-L-arabinotetraose didn’t interact with any of the above proteins. This is the first report concerning a successful study and understanding of the catalytic mechanisms of ferulic acid esterases from the fungi F. oxysporum and S. thermophile, using molecular techniques and bioinformatics tools, indicating a new beginning in the exploitation of these enzymes in various fields of industry.