Έκφραση και εφαρμογή νέων ενζύμων στην αποικοδόμηση
συνθετικών πολυμερών

Νούση, Τέρεντς; Nousi, Terents

dc.contributor.author	Νούση, Τέρεντς	el
dc.contributor.author	Nousi, Terents	en
dc.date.accessioned	2025-01-31T11:41:42Z
dc.date.available	2025-01-31T11:41:42Z
dc.identifier.uri	https://dspace.lib.ntua.gr/xmlui/handle/123456789/61042
dc.identifier.uri	http://dx.doi.org/10.26240/heal.ntua.28738
dc.rights	Αναφορά Δημιουργού-Όχι Παράγωγα Έργα 3.0 Ελλάδα	*
dc.rights.uri	http://creativecommons.org/licenses/by-nd/3.0/gr/	*
dc.subject	Plastics	en
dc.subject	Πλαστικά	el
dc.subject	Biodegradation	en
dc.subject	Heterologous expression	en
dc.subject	Polyurethane	en
dc.subject	Fyrosinase	en
dc.subject	Βιοαποικοδόμηση	el
dc.subject	Ετερόλογη έκφραση	el
dc.subject	Πολυουρεθάνη	el
dc.subject	Τυροσινάση	el
dc.title	Έκφραση και εφαρμογή νέων ενζύμων στην αποικοδόμηση συνθετικών πολυμερών	el
dc.title	Expression and application of novel enzymes in the degradation of synthetic polymers	en
heal.type	bachelorThesis
heal.classification	Βιομηχανική Βιοτεχνολογία	el
heal.classification	Industrial Biotechnology	en
heal.language	el
heal.language	en
heal.access	free
heal.recordProvider	ntua	el
heal.publicationDate	2024-09
heal.abstract	Η σύγχρονη κοινωνία αντιμετωπίζει μια πρωτοφανή κρίση διαχείρισης των πλαστικών αποβλήτων. Η ανεπάρκεια των υφιστάμενων στρατηγικών υποδεικνύει την επιτακτική ανάγκη για την ανάπτυξη καινοτόμων λύσεων. Η εξεύρεση νέων ενζύμων ικανών να αποικοδομούν αποτελεσματικά τα πλαστικά αποτελεί μια πολλά υποσχόμενη κατεύθυνση έρευνας, καθώς η βιοτεχνολογία προσφέρει προηγμένες μεθόδους για την αντιμετώπιση αυτού του περιβαλλοντικού προβλήματος. Στο πλαίσιο ενίσχυσης την ενζυμικής αποικοδόμησης, στην παρούσα έρευνα μελετήθηκαν εφτά νέα ένζυμα. Τα τέσσερα από αυτά, προέρχονται από τον ασκομύκητα Fusarium oxysporum BPOP18 εκ των οποίων τα τρία ανήκουν στην κατηγορία των υδρολασών (αμιδάση, πρωτεάση, ενδοπεπτιδάση) και το τέταρτο είναι οξειδωτικής φύσεως (τυροσινάση). Αντίστοιχα, τα υπόλοιπα τρία μελετώμενα ένζυμα έχουν προέλευση από τον νηματοειδή μύκητα Aspergillus parasiticus MM36 και χαρακτηρίζονται ως μη εξειδικευμένες υπεροξυγενάσες (UPOs) με τις ονομασίες Astra551984, Astra579462 και Astra585095. Μέσω βιοπληροφορικών εργαλείων (BLAST®), εντοπίστηκαν ομόλογες πρωτεΐνες προκειμένου να εξακριβωθεί η πιθανή τους δράση. Όλα τα γονίδια των ανωτέρω ενζύμων, συντέθηκαν με χημικό τρόπο και ενσωματώθηκαν στον πλασμιδιακό φορέα pPICZa A. Εν συνεχεία πραγματοποιήθηκε μετασχηματισμός με ηλεκτροδιάτρηση στον ξενιστή P. pastoris προκειμένου να ακολουθήσει η ετερόλογη έκφραση. Ελέγχθηκαν δύο στελέχη του ξενιστή, ως προς την ικανότητα έκφρασης, το στέλεχος X33 και το SMD1168. Το τελευταίο παρουσίασε εγγενής πρωτεολυτική δράση και απορρίφθηκε. Από τα εξεταζόμενα ένζυμα, μόνο η έκφραση της τυροσινάσης και της αμιδάσης καθίσταται εφικτή. Στο εγχείρημα έκφρασης των UPOs, ναι μεν εκφράστηκαν ένζυμα με οξειδωτική δράση, ωστώσο δεν μπόρεσαν να ταυτοποιηθούν με τις υπεροξειδάσες ενδιαφέροντος με καμία από τις τεχνικές που δοκιμάστηκαν. Η αμιδάση απομονώθηκε με την μέθοδο μεταλλοχηλικής χρωματογραφίας, ενώ η τυροσινάση με χρωματογραφία ιοντικής εναλλαγής. Ο πειραματικός προσδιορισμός των μοριακών βαρών τους με ηλεκτροφόρηση σε γέλη πολυακρυλαμιδίου, έδειξε ότι η αμιδάση γλυκοζυλιώνεται με αποτέλεσμα να εμφανίζει μοριακό βάρος περίπου ίσο με 48kDa. Αντίστοιχα, η τυροσινάση πρωτεολύεται σε δύο πρωτεϊνικά μέρη των 20kDa και 42kDa, πιθανότατα για να αποκτήσει την ενεργή της μορφή. Ύστερα, ακολούθησε ο χαρακτηρισμός των εκφραζόμενων ενζύμων. Η τυροσινάση εμφάνισε βέλτιστο pH καταλυτικής δράσης σε τιμή ίση με 8,5 ενώ η αντίστοιχη θερμοκρασία ήταν οι 40℃. Η αμιδάση εμφάνισε βέλτιστο pH την τιμή 4,5, ωστόσο τονίζεται ότι υπήρξε αδυναμία στην εμφάνιση ενεργότητας σε πολλά υποστρώματα γεγονός που οφείλεται να διερευνηθεί περεταίρω. Έπειτα, πραγματοποιήθηκε έλεγχος τριών μεταλλάξεων (T, L και DM) της κουτινάσης, του ίδιου μύκητα που έχει χαρακτηριστεί, αλλά και μερικών εμπορικών πρωτεασών ως προς την καταλυτική τους δράση στην πολυουρεθάνη (PU), 5 προκειμένου να βρεθεί ο κατάλληλος συνεργηστικός συνδυασμός με τα εκφραζόμενα ένζυμα. Από τον έλεγχο αυτό βρέθηκε ότι η κουτινάση φυσικού τύπου και η εμπορική πρωτεάση Savinase 16L (Σαβινάση), Novozymes εμφάνισαν την μεγαλύτερη απόδοση. Ειδικότερα, προσδιορίστηκε μείωση στο βάρος του PU κατά 5,3% και 14,2% από την κουτινάση και την σαβινάση αντίστοιχα. Η συνεργιστική δράση ανέδειξε τον συνδυασμό σαβινάσης και τυροσινάσης ως τον αποδοτικότερο στην αποσύνθεση του PU με μείωση βάρους κατά 6,6%. Ωστόσο, κανένας συνεργητισμός δεν απέδωσε καλύτερα από την μεμονωμένη δράση της σαβινάσης. Όλες οι εφαρμογές στο PU, πραγματοποιήθηκαν στους 35℃ για 3 ημέρες και pH 8,0 (με εξαίρεση την αμιδάση που έγινε σε pH 5,0). Τέλος, όσο αναφορά τα ένζυμα με οξειδωτική δράση, δοκιμάστηκαν ως προς σε πολυαιθυλένιο χαμηλής πυκνότητας (LDPE) και προσδιορίστηκε με την μέθοδο ATR, ότι πράγματι μεταβάλλεται η δομή του, αφού εμφανίζονται νέες χαρακτηριστικές ομάδες. Η εφαρμογή τους στο πλαστικό έγινε σε pH 6,0 στους 35℃ για 3 ημέρες. Η ταυτοποίηση των συγκεκριμένων ενζύμων και η ενδελεχής μελέτη τους κρίνεται απαραίτητη.	el
heal.abstract	Modern society is facing an unprecedented crisis in the management of plastic waste. The inadequacy of existing strategies highlights the urgent need for innovative solutions. The discovery of new enzymes capable of effectively degrading plastics is a promising research direction, as biotechnology offers advanced methods for addressing this environmental problem. To enhance enzymatic degradation, this study investigated seven novel enzymes. Four of these were derived from the ascomycete Fusarium oxysporum BPOP18, of which three belong to the hydrolase category (amidase, protease, endopeptidase) and the fourth is oxidative in nature (tyrosinase). Similarly, the remaining three studied enzymes originated from the filamentous fungus Aspergillus parasiticus MM36 and are characterized as non-specific peroxidases (UPOs) named Astra55, Astra57, and Astra58. Through bioinformatics tools (BLAST®), homologous proteins were identified to ascertain their potential function. All genes of the aforementioned enzymes were chemically synthesized and integrated into the plasmid vector pPICZa A. Subsequently, electroporation was performed on the host P. pastoris to follow heterologous expression. Two strains of the host were tested for expression ability, strain X33 and SMD1168. The latter exhibited intrinsic proteolytic activity and was rejected. Of the enzymes examined, only the expression of tyrosinase and amidase was feasible. In the UPO expression project, host peroxidases were expressed instead of the desired enzymes, which exhibited strong oxidative activity and were not present in the wild type of strain X33. The amidase was isolated using metal chelate chromatography, while tyrosinase was isolated using ion exchange chromatography. The experimental determination of molecular weights by polyacrylamide gel electrophoresis showed that the amidase is glycosylated, resulting in a molecular weight of approximately 48 kDa. Similarly, tyrosinase is proteolyzed into two protein parts of 20 kDa and 42 kDa, probably to acquire its active form. Subsequently, the characterization of the expressed enzymes was carried out. Tyrosinase exhibited optimal catalytic activity at pH 8.5, while the corresponding temperature was 40°C. The amidase exhibited an optimal pH of 4.5, however, it is emphasized that there was a failure to show activity on many substrates, a fact that needs to be further investigated. Next, three mutations (T, L, and DM) of cutinase, from the same fungus that has been characterized, as well as some commercial proteases were tested for their catalytic activity on polyurethane (PU), in order to find the appropriate synergistic combination with the expressed enzymes. From this test, it was found that the wild type cutinase and the commercial protease Savinase 16L Novozymes, exhibited the highest performance. Specifically, a weight reduction of 5.3% and 14.2% was determined by cutinase and savinase, respectively. The synergistic action revealed the combination of savinase and tyrosinase as the most efficient in the degradation of PU with a weight reduction of 6.6%. However, no synergy performed better than the 7 individual action of savinase. All applications on PU were carried out at 35°C for 3 days and pH 8.0 (except for amidase which was performed at pH 5.0). Finally, regarding the unidentified host peroxidases, they were tested for their oxidative activity on low-density polyethylene (LDPE) and it was determined by the ATR method that new functional groups are formatted. Their application to the plastic was carried out at pH 6.0 at 35°C for 3 days. The identification of these specific enzymes and their in-depth study is considered necessary.	en
heal.advisorName	Topakas, Evangelos	en
heal.committeeMemberName	Topakas, Evangelos	en
heal.committeeMemberName	Vouyiouka, Stamatina	en
heal.committeeMemberName	Protogerou, Aimilia	en
heal.academicPublisher	Εθνικό Μετσόβιο Πολυτεχνείο. Σχολή Χημικών Μηχανικών. Τομέας Σύνθεσης και Ανάπτυξης Βιομηχανικών Διαδικασιών (IV)	el
heal.academicPublisherID	ntua
heal.numberOfPages	198 σ.	el
heal.fullTextAvailability	false