Ενίσχυση της δυνατότητας αποικοδόμησης πολυ(τερεφθαλικού αιθυλεστέρα) (PET) από δύο καινοτόμες βακτηριακές πολυεστεράσες με μεθόδους πρωτεϊνικής μηχανικής

Παναγιωτόπουλους, Άρης; Panagiotopoulos, Aris

dc.contributor.author	Παναγιωτόπουλους, Άρης	el
dc.contributor.author	Panagiotopoulos, Aris	en
dc.date.accessioned	2025-03-21T09:26:10Z
dc.date.available	2025-03-21T09:26:10Z
dc.identifier.uri	https://dspace.lib.ntua.gr/xmlui/handle/123456789/61400
dc.identifier.uri	http://dx.doi.org/10.26240/heal.ntua.29096
dc.rights	Default License
dc.subject	Enzymatic degradation	en
dc.subject	Protein engineering	en
dc.subject	Directed mutagenesis	en
dc.subject	Polyesterases	en
dc.subject	PET	en
dc.subject	Ενζυμική αποικοδόμηση	el
dc.subject	Πρωτεϊνική μηχανική	el
dc.subject	Κατευθυνόμενη μεταλλαξιγένεση	el
dc.subject	Πολυεστεράσες	el
dc.title	Ενίσχυση της δυνατότητας αποικοδόμησης πολυ(τερεφθαλικού αιθυλεστέρα) (PET) από δύο καινοτόμες βακτηριακές πολυεστεράσες με μεθόδους πρωτεϊνικής μηχανικής	el
dc.title	Enhancement of polyethylene terephthalate (PET) degradation capacity of two novel bacterial polyesterases using protein engineering methods	en
heal.type	bachelorThesis
heal.classification	Βιοτεχνολογία	el
heal.classification	Biotechnology	en
heal.language	el
heal.access	free
heal.recordProvider	ntua	el
heal.publicationDate	2024-10-15
heal.abstract	The rapidly increasing production and extensive use of plastics have led to crucial repercussions on humans and the environment. The accumulation of non-biodegradable plastics and the environmental consequences of conventional waste management methods have prompted the search for new solutions with a lower environmental footprint. The use of enzymes for the biodegradation of polymeric materials presents a promising method. In this thesis, the enhancement of the degradation capacity of polyethylene terephthalate (PET) by two polyesterases from the bacteria Deinococcus maricopensis (DmPETase) and Moraxella sp. (MoPE) was studied. For the DmPETase gene, protein engineering tools were used with the aid of artificial intelligence so as to design disulfide bonds that would increase its thermostability and catalytic activity. Moreover, for the MoPE gene, protein engineering methods were applied, by aligning the structures of known PET-degrading enzymes (TfCut, TaCut, Cut190, LCC, IsPETase, RgPETase, and PaPEH), and with the aid of literature, mutations were designed that would increase enzyme selectivity and activity towards PET. Initially, the expression genes of the DmPETase (DmPETase_AA, DmPETase_DY, DmPETase_ST, and DmPETase_WT) and MoPE (V96T, D127G, Y188W, Y216S, F220I, F239I, S242N, S242D, Y188W/F220I, Y188W/Y216S, Y216S/F220I/Y188W, and Y216S/F220I) mutants, that carried the respective point mutations after polymerase chain reaction (PCR), were introduced into the plasmid vectors pET-22b(+) and pET-26b(+) and heterologously expressed in Escherichia coli SHuffle T7 and Escherichia coli BL21 (DE3), respectively. The mutants were isolated and subjected to biochemical characterization. All mutants exhibited ester activity against the pNPB substrate, with DmPETase_AA, MoPE_S242N, and MoPE_D127G displaying significantly higher activity than the DmPETase_WT and MoPE_WT mutants (2.4-fold, 2.2-fold, and 2.0-fold, respectively). Regarding the thermostability of the DmPETase mutants, no increase in stability was observed at 70 °C, while at 90 °C for 30 minutes duration, all mutants except the WT lost at least 80% of their relative activity. Finally, after determining the melting temperature (Tm) of the DmPETase mutants through differential scanning fluorometry (DSF), it was found that DmPETase_AA exhibited a lower Tm by 3.68 ± 0.11 °C. Subsequently, all mutants were subjected to reactions with PET. The DmPETase mutants reacted with crystalline PET at 55 °C, while the MoPE mutants with amorphous PET at 30 °C. Additionally, the synergy of enzyme system of DmPETase and ZcMHETase was studied at 55 °C with crystalline PET. The degradation capacity of plastic substrate was significantly increased in the DmPETase_AA, MoPE_S242N, MoPE_D127G, and MoPE_Y216S/F220I/Y188W mutants, by 1.6, 2.0, 2.1, 2.8, and 4.4-fold, compared to the WT mutant, respectively. Hence, protein engineering enhanced the PET hydrolysis capacity. Furthermore, synergistic action of the enzymes was observed, on the grounds that the production of water-soluble products was increased by 8.5%.	en
heal.abstract	Η ταχέως αυξανόμενη παραγωγή και η εκτεταμένη χρήση των πλαστικών έχουν επιφέρει σημαντικές επιπτώσεις στον άνθρωπο και το περιβάλλον. Η συσσώρευση των μη βιοαποικοδομήσιμων πλαστικών και το περιβαλλοντικό αντίκρισμα των συμβατικών μεθόδων διαχείρισης απορριμμάτων έχουν οδηγήσει στην εύρεση νέων λύσεων με χαμηλότερο περιβαλλοντικό αποτύπωμα. Η χρήση ενζύμων για τη βιοαποικοδόμηση πολυμερικών υλικών αποτελεί μια ελπιδοφόρα μέθοδος. Στη παρούσα διπλωματική εργασία, μελετήθηκε η ενίσχυση της αποικοδομητικής ικανότητας του πολυ(τερεφθαλικού αιθυλεστέρα) (PET) από δύο πολυεστεράσες, από τα βακτήρια Deinococcus maricopensis (DmPETase) και Moraxella sp. (ΜοPE). Για το γονίδιο της DmPETase, χρησιμοποιήθηκαν εργαλεία πρωτεϊνικής μηχανικής, με τη συμβολή της τεχνητής νοημοσύνης, για το σχεδιασμό δισουλφιδικών δεσμών που θα επιφέρουν αύξηση της θερμοσταθερότητας και της καταλυτικής δράσης του. Επιπλέον, στο γονίδιο της MoPE χρησιμοποιήθηκαν μέθοδοι πρωτεϊνικής μηχανικής με ευθυγράμμιση των δομών γνωστών ενζύμων αποικοδόμησης του PET (TfCut, TaCut, Cut190, LCC, IsPETase, RgPETase και PaPEH) και με τη βοήθεια της βιβλιογραφίας σχεδιάστηκαν μεταλλάξεις που θα αυξήσουν την εκλεκτικότητα και ενεργότητα του ενζύμου έναντι στο PET. Αρχικά, τα γονίδια έκφρασης των μεταλλαγμάτων της DmPETase (DmPETase_AA, DmPETase_DY, DmPETase_ST και DmPETase_WT) και της MoPE (V96T, D127G, Y188W, Y216S, F220I, F239I, S242N, S242D, Y188W/F220I, Y188W/Y216S, Y216S/F220I/Y188W και Y216S/F220I), που φέρουν τις αντίστοιχες σημειακές μεταλλάξεις έπειτα από τη διαδικασία αλυσιδωτής αντίδρασης πολυμεράσης (PCR), εισήχθησαν σε πλασμιδιακούς φορείς pET-22b(+) και pET-26b(+), και εκφράστηκαν ετερόλογα σε επιδεκτικά κύτταρα Escherichia coli SΗuffle Τ7 και Escherichia coli BL21 (DE3), αντιστοίχως. Τα μεταλλάγματα απομονώθηκαν και οδηγήθηκαν σε βιοχημικό χαρακτηρισμό. Όλα τα μεταλλάγματα έφεραν εστερική δράση έναντι στο υπόστρωμα pNPB, με τα DmPETase_AA, MoPE_S242N και MoPE_D127G να εμφανίζουν σημαντικά υψηλότερή ενεργότητα από τα DmPETase_WT και ΜοPE_WT μεταλλάγματα (2,4-φορές, 2,2-φορές και 2,0-φορές, αντίστοιχα). Αναφορικά με τη θερμοσταθερότητα των μεταλλαγμάτων της DmPETase, δεν παρατηρήθηκε αύξηση της σταθερότητας στη θερμοκρασία των 70 °C, ενώ στους 90 °C σε χρόνο 30 λεπτών όλα τα μεταλλάγματα εκτός από το WT είχαν χάσει τουλάχιστον το 80% της σχετικής ενεργότητας τους. Τέλος, έπειτα του προσδιορισμού της θερμοκρασίας τήξης (Tm) των μεταλλαγμάτων της DmPETase μέσω φθορισμομετρίας διαφορικής σάρωσης (DSF), προσδιορίστηκε ότι η DmPETase_AA εμφάνισε μικρότερη Tm κατά 3,68 ± 0,11 °C. Στη συνέχεια όλα τα μεταλλάγματα υποβλήθηκαν σε αντιδράσεις με PET. Τα μεταλλάγματα της DmPETase αντέδρασαν με κρυσταλλικό PET στους 55 °C, ενώ τα μεταλλάγματα της MoPE με άμορφο PET στους 30 °C. Παράλληλα μελετήθηκε και ο συνεργιτισμός του συστήματος ενζύμων DmPETase και ZcMHETase στους 55 °C με κρυσταλλικό PET. H ικανότητα υποβάθμισης των πλαστικών υποστρωμάτων αυξήθηκε σημαντικά στα μεταλλάγματα DmPETase_AA, MoPE_S242N, MoPE_D127G, MoPE_Υ216S/F220I/Y288W, κατά 1,6, 2,0, 2,1, 2,8 και 4,4 φορές συγκριτικά με το WT μετάλλαγμα, αντίστοιχα. Έτσι η πρωτεϊνική μηχανικής επέφερε αύξηση ικανότητας υδρόλυσης PET. Επίσης παρατηρήθηκε συνεργιτική δράση των ενζύμων, καθώς αυξήθηκε η παραγωγή των υδατοδιαλυτών προϊόντων κατά 8,5%.	el
heal.advisorName	Topakas, Evangelos	en
heal.advisorName	Τόπακας, Ευάγγελος	el
heal.committeeMemberName	Τόπακας, Ευάγγελος	el
heal.committeeMemberName	Βουγιούκα, Σταματίνα	el
heal.committeeMemberName	Μπουρουσιάν, Μιρτάτ	el
heal.academicPublisher	Εθνικό Μετσόβιο Πολυτεχνείο. Σχολή Χημικών Μηχανικών. Τομέας Σύνθεσης και Ανάπτυξης Βιομηχανικών Διαδικασιών (IV)	el
heal.academicPublisherID	ntua
heal.numberOfPages	152 σ.	el
heal.fullTextAvailability	false