Ετερόλογη έκφραση και χαρακτηρισμός ενζύμων που σχετίζονται με την αποτοξικοποίηση του αντιβιοτικού στρεπτοθρισίνη

Παρασκευά, Αναστασία; Paraskeva, Anastasia

dc.contributor.author	Παρασκευά, Αναστασία	el
dc.contributor.author	Paraskeva, Anastasia	en
dc.date.accessioned	2025-03-28T09:31:38Z
dc.date.available	2025-03-28T09:31:38Z
dc.identifier.uri	https://dspace.lib.ntua.gr/xmlui/handle/123456789/61526
dc.identifier.uri	http://dx.doi.org/10.26240/heal.ntua.29222
dc.rights	Default License
dc.subject	Ακετυλοτρανσφεράση	el
dc.subject	Ετερόλογη έκφραση	el
dc.subject	Βιοχημικός χαρακτηρισμός	el
dc.subject	Αμυδουδρολάση	el
dc.subject	AMR	en
dc.title	Ετερόλογη έκφραση και χαρακτηρισμός ενζύμων που σχετίζονται με την αποτοξικοποίηση του αντιβιοτικού στρεπτοθρισίνη	el
heal.type	bachelorThesis
heal.classification	Βιοτεχνολογία	el
heal.language	el
heal.access	free
heal.recordProvider	ntua	el
heal.publicationDate	2024-10-01
heal.abstract	H ανθεκτικότητα στα αντιβιοτικά (AMR) είναι μια από τις κυριότερες απειλές για παγκόσμια υγεία και ανάπτυξη. Σύμφωνα με την αναφορά του Παγκόσμιου Οργανισμού Υγείας, το 2019, η AMR ήταν άμεσα υπεύθυνη για τους θανάτους 700,000 ανθρώπων. Παράλληλα υπάρχουν πολύ λίγα νέα αντιβιοτικά που ανακαλύπτονται και εισάγονται στη γραμμή κλινικών δοκιμών. Μια λύση στις προκλήσεις αυτές είναι η επανεξέταση αντιβιοτικών που είχαν απορριφθεί προηγουμένως λόγω της τοξικότητάς τους. Ένα τέτοιο αντιβιοτικό, για το οποίο υπάρχει ανανεωμένο επιστημονικό ενδιαφέρον τα τελευταία χρόνια, είναι η στρεπτοθρισίνη. Παρότι η στρεπτοθρισίνη είναι ένα από τα πρώτα αντιβιοτικά που ανακαλύφθηκε δεν χρησιμοποιήθηκε ποτέ κλινικά και ως συνέπεια οι βακτηριακοί μηχανισμοί ανθεκτικότητας έναντι σε αυτή δεν είναι επαρκώς χαρακτηρισμένοι. Στόχος της παρούσας διπλωματικής ήταν να διερευνηθεί ο ενδογενής μηχανισμός ανθεκτικότητας στη στρεπτοθρισίνη του βακτηριακού στέλεχους Streptomyces sp. strain M18, στέλεχος το οποίο είναι παραγωγός της στρεπτοθρισίνης. Στο γονιδίωμα του στρεπτομύκητα εντοπίστηκαν οι αλληλουχίες τριών ενζύμων -μία αμιδοϋδρολάση (amdhy) και δύο ακετυλοτρανσφεράσες (Sat1 και Sat2)- οι οποίες πιθανώς αποτοξικοποιούσαν το αντιβιοτικό στρεπτοθρισίνη. Αρχικά, πραγματοποιήθηκε in vivo μελέτη της δράσης των ενζύμων στο βακτήριο E.coli το οποίο είναι ευαίσθητο στη στρεπτοθρισίνη. Πιο συγκεκριμένα τα γονίδια που κωδικοποιούσαν την αμιδοϋδρολάση και την ακετυλοτρανσφεράση της στρεπτοθρισίνης εισάχθηκαν αυτόνομα σε πλασμιδιακό φορέα pET-15b16s. Τα ανασυνδυασμένα πλασμίδια στη συνέχεια μετασχηματίστηκαν σε επιδεκτικά κύτταρα E. coli και αναπτύχθηκαν παρουσία στρεπτοθρισίνης. Η αμιδοϋδρολάση δεν αποτοξικοποίησε την στρεπτοθρισίνη και άρα δεν προσέφερε ανθεκτικότητα στον E.coli. Αντιθέτως, τόσο η Sat1 όσο και η Sat2 αποτοξικοποιήσαν την στρεπτοθρισίνη. Αφού επιβεβαιώθηκε η δράση των ακετυλοτρασφερασών υπολογίστηκε η συγκέντρωση MIC της στρεπτοθρισίνης για το E.coli, και βρέθηκε ίση με >800 μΜ. Από τις καμπύλες ανάπτυξης του E.coli με τα γονίδια των ακετυλοτρανσφερασών βρέθηκε ότι το E.coli με το γονίδιο της Sat1 έχει μεγαλύτερο μέγιστο ρυθμό ανάπτυξης και μικρότερο χρόνο διπλασιασμού συγκριτικά με τη Sat2, υποδεικνύοντας ότι συνθήκες ανάπτυξης είναι ευνοϊκότερες παρουσία της Sat1. Πραγματοποιήθηκε η υπερέκφραση των Sat1 και Sat2 σε E. coli. Για την απομόνωση των πρωτεϊνών χρησιμοποιήθηκε χρωματογραφία ιοντοανταλλαγής (Ni2+ -NTA). Με χρήση ηλεκτροφόρησης SDS-PAGE το μοριακό βάρος των ενζύμων βρέθηκε για την Sat1 ίσο με 22 kDa και για τη Sat2 ίσο με 23 kDa. Η ποσοτικοποίηση της ακετυλίωσης έδειξε ότι Sat1 είναι σημαντικά πιο δραστική σε σχέση με τη Sat2, με περίπου 6 φορές μεγαλύτερη ενεργότητα (1.67 Units/ml και 0.28 Units/ml αντίστοιχα). Στη συνέχεια βρέθηκε το βέλτιστο pH και για τις δύο ακετυλοτρανσφεράσες ίσο με 8 και υπολογίστηκαν οι κινητικές σταθερές, για τη Sat1 KM =83.65μΜ, Vmax =6.543 μΜ/min και για τη Sat2 KM =364.09μΜ, Vmax =11.84 μΜ/min. Επόμενο βήμα ήταν η μελέτη των ακετυλοτρανσφερασών για την πιθανή τους δράση σε άλλα υποστρώματα όπου εντοπίστηκε δράση στο υπόστρωμα χλωροαμφενικόλη από το ένζυμο Sat2. Με υπόστρωμα την χλωροαμφενικόλη υπολογίστηκαν για τη Sat2 η ενεργότητα 0.14 Unit/ml και οι κινητικές σταθερές, η KM ίση με 65.53 μM και η Vmax ίση με 2.43 μΜ/min.	el
heal.abstract	Antimicrobial resistance (AMR) is a major threat to global health and development. According to a 2019 report by the World Health Organization, AMR was directly responsible for the deaths of 700,000 people. Meanwhile, there are few new antibiotics discovered and introduced in clinical trials. One solution to these problems is the re evaluation of previously discarded antibiotics. One such antibiotic that has gained renewed scientific interest in recent years is streptothricin. Although streptothricin was one of the first antibiotics discovered, it was never used clinically, and as a consequence, the bacterial resistance mechanisms against it are not well characterized. The aim of this thesis was to investigate the endogenous resistance mechanism to streptothricin of the bacterial strain Streptomyces sp. M18, a streptothricin-producing strain. The genome of Streptomyces sp. strain Μ18 was sequenced and three enzymes which likely detoxified streptothricin were identified —one amidohydrolase (amdhy) and two acetyltransferases (Sat1 and Sat2). Initially, an in vivo study was conducted to examine the action of these enzymes using the heterologous expression system of E. coli, which is sensitive to streptothricin. Specifically, genes encoding the amidohydrolase and acetyltransferases of streptothricin were inserted into a plasmid vector (pET-15b16s). These recombinant plasmids were then introduced to E. coli competent cells, which were grown in the presence of streptothricin. The amidohydrolase did not detoxify streptothricin and therefore did not confer resistance in E. coli. In contrast, both Sat1 and Sat2 detoxified streptothricin. After confirming the action of the acetyltransferases, the minimum inhibitory concentration (MIC) of streptothricin for E. coli was calculated and found to be >800 μM. Growth curves of E. coli strains carrying acetyltransferase genes revealed that E. coli strain carrying the Sat1 gene had a higher growth rate and shorter doubling time compared to E. coli strain carrying Sat2 gene, indicating that growth conditions were favorable in the presence of Sat1. Overexpression of Sat1 and Sat2 was performed in E. coli, and the proteins were isolated using ion-exchange chromatography (Ni2+-NTA). Molecular weights of Sat1 and Sat2, as determined by SDS-PAGE electrophoresis were 22 kDa and 23 kDa, respectively. The quantification of acetylation showed that Sat1 was significantly more active than Sat2, with approximately six-fold higher activity (1.67 Units/ml vs. 0.28 Units/ml, respectively). The optimum pH for both acetyltransferases was found to be pH 8, and their kinetic constants were calculated. For Sat1, KM = 83.65 μM and Vmax = 6.543 μM/min, while for Sat2, KM = 364.09 μM and Vmax = 11.84 μM/min. Next, the potential activity of acetyltransferases on other substrates was studied, where Sat2 was found to acetylate the antibiotic chloramphenicol. With chloramphenicol as the substrate, Sat2's activity was measured at 0.14 Units/ml, and its kinetic constants were KM = 65.53 μM and Vmax = 2.43 μM/min.	en
heal.advisorName	Μαμμά, Διόμη	el
heal.advisorName	Χατζηνικολάου, Δημήτριος	el
heal.committeeMemberName	Μαμμά, Διόμη	el
heal.committeeMemberName	Χατζηνικολάου, Δημήτριος	el
heal.committeeMemberName	Καραντώνης, Αντώνιος	el
heal.academicPublisher	Εθνικό Μετσόβιο Πολυτεχνείο. Σχολή Χημικών Μηχανικών. Τομέας Σύνθεσης και Ανάπτυξης Βιομηχανικών Διαδικασιών (IV)	el
heal.academicPublisherID	ntua
heal.numberOfPages	98 σ.	el
heal.fullTextAvailability	false