Ανάπτυξη και εφαρμογή μεθόδου προσδιορισμού ολικών μικροκυστινών

Ράπτης, Ιωάννης; Raptis, Ioannis

dc.contributor.author	Ράπτης, Ιωάννης	el
dc.contributor.author	Raptis, Ioannis	en
dc.date.accessioned	2025-04-04T07:33:07Z
dc.date.available	2025-04-04T07:33:07Z
dc.identifier.uri	https://dspace.lib.ntua.gr/xmlui/handle/123456789/61623
dc.identifier.uri	http://dx.doi.org/10.26240/heal.ntua.29319
dc.rights	Default License
dc.subject	MMPB	en
dc.subject	Μικροκυστίνες	el
dc.subject	Οξείδωση Lemieux	el
dc.subject	SPE	en
dc.subject	LC-MS/MS	en
dc.subject	Microcystins	en
dc.subject	MMPB	en
dc.subject	Lemieux oxidation	en
dc.subject	SPE	en
dc.subject	LC-MS/MS	en
dc.title	Ανάπτυξη και εφαρμογή μεθόδου προσδιορισμού ολικών μικροκυστινών	el
heal.type	bachelorThesis	el
heal.classification	Analytical Chemistry	en
heal.access	free	el
heal.recordProvider	ntua	el
heal.publicationDate	2024-10-10
heal.abstract	Οι μικροκυστίνες είναι κυκλικά επταπεπτίδια µε ηπατοτοξική δράση και αποτελούν τοξικούς δευτερογενείς μεταβολίτες των κυανοβακτηριών, γνωστοί ως κυανοτοξίνες. Οι µικροκυστίνες προκαλούν σοβαρή βλάβη στο συκώτι. Συγκεκριµένα, προκαλούν διάσπαση της δοµής των ηπατικών κυττάρων, αύξηση του βάρους του συκωτιού λόγω ενδοηπατικής αιµορραγίας, αιµοδυναµικό σοκ, καρδιακή ανεπάρκεια και τελικά θάνατο σε ανθρώπους, ψάρια, πτηνά, ζωοπλανγκτόν, μύδια και θηλαστικά. Οι μικροκυστίνες διαθέτουν κυκλική επταπεπτιδική δομή με το Adda (3 - άµινο - 9 - µέθοξυ - 2,6,8 - τριµέθυλ - 10 -φαινυλδεκα - 4,6 - διενοϊκό οξύ) να είναι το αμινοξύ που αποτελεί χαρακτηριστικό αυτής της οµάδας των κυανοτοξινών και στο οποίο οφείλετε κυρίως η τοξικότητα τους. Επομένως, αποτελεί σημαντική πρόκληση ο προσδιορισμός των ολικών μικροκυστινών λαμβανόντας υπόψη την υψηλή τοξικότητα τους. Μεταξύ των μεθόδων προσδιορισμού μικροκυστινών στο νερό υπάρχουν εκείνες με τις οποίες μπορεί να υπολογιστεί η συγκέντρωση του συνόλου τους (ELISA και PPIA) καθώς και εκείνες με τις οποίες προσδιορίζονται οι συγκεντρώσεις επιλεγμένων μικροκυστινών (HLPC-PDA, LC-MS και LC-MS/MS). Παρότι με τις τεχνικές στοχευμένης ανίχνευσης (HLPC-PDA, LC-MS και LC-MS/MS) επιτυγχάνεται αξιόπιστος προσδιορισμός των επιμέρους μικροκυστινών, δεν μπορεί να εκτιμηθεί το σύνολο τους λόγω του περιορισμένου αριθμού των εμπορικά διαθέσιμων αναλυτικών προτύπων που χρησιμοποιούνται στην ανάλυση. Οι βιοχημικές τεχνικές ELISA και ΡΡΙΑ παρέχουν πληροφορία σχετικά με τη συγκέντρωση των ολικών μικροκυστινών όμως είναι απαραίτητη η προμήθεια δαπανηρών εμπορικά διαθέσιμων κιτ για τον προσδιορισμό. Στην παρούσα μελέτη, για τον προσδιορισμό των ολικών μικροκυστινών στο νερό έγινε ανάπτυξη αναλυτικής μεθόδου που βασίζεται στον προσδιορισμό του ΜΜΡΒ (2-μεθυλο-3μεθοξυ-4 φαινυλοβουτυρικό οξύ) που προκύπτει από την οξείδωση και απόσπαση του χαρακτηριστικού αμινοξέος Adda των μικροκυστινών, με βάση την αντίδραση οξείδωσης Lemieux. Ο καθαρισμός και η απομόνωση του ΜΜPB μετά την αντίδραση, έγινε με χρήση της τεχνικής εκχύλισης στερεάς φάσης (SPE) και η ανάλυση για τον προσδιορισμό του MMPB έγινε με υγρή χρωματογραφία συζευγμένη με φασματομετρία μαζών (LC-MS/MS). Αυτή η τεχνική προσφέρει μια απλή στην εκτέλεση και ταυτόχρονα μη κοστοβόρα μέθοδο για τον προδιορισμό των ολικών μικροκυστινών που για να πραγματοποιηθεί δεν χρειάζεται την χρήση προτύπων μικροκυστινών ούτε και την προμήθεια βιοχημικών κιτ. Με βάση τα αποτελέσματα της παρούσας μελέτης προκύπτει ότι η τεχνική είναι ειδική ως προς την ανίχνευση του αμινοξέος Adda και συνεπώς ανιχνεύει το σύνολο των μικροκυστινών συμπεριλαμβανομένων και των προϊόντων μετασχηματισμού τους που εμπεριέχουν το Adda. Η μέθοδος παρουσίασε γραμμικότητα από 0.5 – 5 μg/L, είχε όριο ανίχνευσης 0.2 μg/L και η πιστότητα της (%RSD) κυμάνθηκε από 25% έως 30%.	el
heal.abstract	Microcystins are cyclic heptapeptides with hepatotoxic properties, classified as cyanotoxins, which are secondary metabolites produced by cyanobacteria. These compounds induce severe hepatic damage, including the disruption of liver cell architecture, increased liver mass due to intrahepatic hemorrhage, hemodynamic shock, cardiac failure, and potentially fatal outcomes in a wide range of organisms, including humans, fish, birds, zooplankton, mussels, and mammals. The toxicity of microcystins is primarily attributed to the presence of the amino acid Adda (3-amino-9-methoxy-2,6,8-trimethyl-10-phenyldeca-4,6-dienoic acid), a unique feature of these cyanotoxins. Currently, more than 300 structural variants of microcystins have been identified, differing in their amino acid composition, which poses significant challenges in accurately quantifying total microcystin content due to their high toxicity. Various analytical methods have been developed for the detection of microcystins in water. These can be broadly categorized into two groups: methods that estimate the total concentration of microcystins, such as enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA) and protein phosphatase inhibition assay (PPIA), and methods that target specific microcystin variants, such as high-performance liquid chromatography-photodiode array detection (HPLC-PDA), liquid chromatography-mass spectrometry (LC-MS), and liquid chromatography-tandem mass spectrometry (LC-MS/MS). While targeted detection techniques (e.g., HPLC-PDA, LC-MS, and LC-MS/MS) provide reliable identification of individual microcystin variants, they are limited in estimating total microcystin content due to the restricted availability of commercial analytical standards. On the other hand, ELISA and PPIA offer a broader estimation of total microcystins, but require expensive commercial kits for analysis. In this study, an analytical method was developed for the determination of total microcystins in water based on the detection of MMPB(2-methyl-3methoxy-4-phenylbutyric acid), a product formed through the oxidation and sequestration of the Adda amino acid, using the Lemieux oxidation reaction. The purification and isolation of MMPB were performed using solid-phase extraction (SPE), followed by analysis via liquid chromatography in conjuction with mass spectrometry (LC-MS/MS). This approach provides a cost-effective and straightforward method for total microcystin detection without the need for microcystin-specific standards or biochemical kits. The results of the study indicate that the method is specific to the detection of Adda-containing microcystins and their transformation products. The method exhibited a linear response in the concentration range of 0.5 to 5 μg/L, with a detection limit of 0.2 μg/L, and a repeatability (relative standard deviation, %RSD) ranging from 25% to 30%.	en
heal.advisorName	Τσόπελας, Φώτης	el
heal.committeeMemberName	Τσόπελας, Φώτης	el
heal.committeeMemberName	Δέτση, Αναστασία	el
heal.committeeMemberName	Μαρούλης, Ζαχαρίας	el
heal.academicPublisher	Εθνικό Μετσόβιο Πολυτεχνείο. Σχολή Χημικών Μηχανικών. Τομέας Χημικών Επιστημών (I)	el
heal.academicPublisherID	ntua	el
heal.numberOfPages	87 σ.	el
heal.fullTextAvailability	false