Βιοχημικός χαρακτηρισμός μιας νέας λυτικής μονοοξυγενάσης των πολυσακχαριτών της οικογένειας AA9 από τον μύκητα Fusarium oxysporum

Γιαννάτος, Διονύσιος; Giannatos, Dionysios

dc.contributor.author	Γιαννάτος, Διονύσιος	el
dc.contributor.author	Giannatos, Dionysios	en
dc.date.accessioned	2025-04-14T09:17:12Z
dc.date.available	2025-04-14T09:17:12Z
dc.identifier.uri	https://dspace.lib.ntua.gr/xmlui/handle/123456789/61740
dc.identifier.uri	http://dx.doi.org/10.26240/heal.ntua.29436
dc.rights	Αναφορά Δημιουργού-Μη Εμπορική Χρήση-Όχι Παράγωγα Έργα 3.0 Ελλάδα	*
dc.rights.uri	http://creativecommons.org/licenses/by-nc-nd/3.0/gr/	*
dc.subject	Λιγνοκυτταρινούχος βιομάζα	el
dc.subject	Λυτικές μονοοξυγενάσες των πολυσακχαριτών	el
dc.subject	Συνεργητισμός	el
dc.subject	Υγρή χρωματογραφία υψηλής απόδοσης εναλλαγής ανιόντων με παλμική αμπερομετρική ανίχνευση	el
dc.subject	Lignocellulose	en
dc.subject	LPMO	en
dc.subject	Lytic polymer monooxygenases	en
dc.subject	HPAE-PAD	en
dc.subject	Synergy	en
dc.title	Βιοχημικός χαρακτηρισμός μιας νέας λυτικής μονοοξυγενάσης των πολυσακχαριτών της οικογένειας AA9 από τον μύκητα Fusarium oxysporum	el
heal.type	bachelorThesis
heal.classification	Βιομηχανική βιοτεχνολογία	el
heal.classification	Industrial biotechnology	en
heal.language	el
heal.access	free
heal.recordProvider	ntua	el
heal.publicationDate	2024-10-02
heal.abstract	Η αξιοποίηση μη ανανεώσιμων πόρων ως πηγών ενέργειας έχει συσχετιστεί με δυσμενείς επιπτώσεις στο περιβάλλον, όπως το φαινόμενο της κλιματικής αλλαγής. Η αξιοποίηση της λιγνοκυτταρινούχου βιομάζας έχει προταθεί ως εναλλακτική στα συμβατικά πετροχημικά, όμως η μηχανική ανθεκτικότητα της αποτελεί σημαντικό εμπόδιο στην αξιοποίηση της. Αυτή η ανθεκτικότητα οφείλεται εν μέρει στην κρυσταλλικότητα της κυτταρίνης, καθιστώντας την δυσπρόσιτη στην υδρόλυση από κυτταρινάσες. Πιθανή λύση μπορούν να δώσουν οι σαπροφυτικοί μύκητες, οι οποίοι είναι ικανοί να αποικοδομούν πλήρως την λιγνοκυτταρινούχο βιομάζα. Σε αυτούς τους οργανισμούς έχουν ταυτοποιηθεί ένζυμα αναφερόμενα ως Λυτικές Μονοοξυγενάσες των Πολυσακχαριτών (LPMOs), μοναδικά λόγω της ικανότητας τους να αποικοδομούν την κρυσταλλική κυτταρίνη μέσω της οξείδωσης του γλυκοζιτικού δεσμού, χρησιμοποιώντας το μοριακό οξυγόνο ή το υπεροξείδιο του υδρογόνου ως συνυπόστρωμα. Αυτή η οξείδωση δημιουργεί νέες θέσεις εκκίνησης για την δράση των υδρολυτικών κυτταρινασών, αυξάνοντας με αυτόν τον τρόπο την απόδοση της διεργασίας. Οι LPMOs έχουν χωριστεί σε 8 οικογένειες στην βάση δεδομένων CAZy (Carbohydrate Active Enzymes), βασιζόμενη στην ομοιότητα των αλληλουχιών των αμινοξέων τους. Στην παρακάτω διπλωματική, χαρακτηρίζεται μια νέα LPMO από τον μικροοργανισμό Fusarium oxysporum, και συγκεκριμένα το στέλεχος FO47, επονομαζόμενη FoLPMO9A. Η πρωτεΐνη εκφράστηκε ετερόλογα χρησιμοποιώντας τον μικροοργανισμό Pichia pastoris ως το σύστημα έκφρασης, και απομονώθηκε χρησιμοποιώντας Χρωματογραφία Συγγένειας Ακινητοποιημένων Μετάλλων (IMAC). Η δράση του ενζύμου μετρήθηκε χρησιμοποιώντας Υγρή Χρωματογραφία Υψηλής Απόδοσης Εναλλαγής Ανιόντων με Παλμική Αμπερομετρική Ανίχνευση (HPAE-PAD), για την ανίχνευση οξειδωμένων ολιγοσακχαριτών που απελευθερώθηκαν στο διάλυμα. Βιοπληροφορικά εργαλεία χρησιμοποιήθηκαν για την πρόβλεψη των ιδιοτήτων της πρωτεΐνης, συμπεριλαμβανομένου της τριτοταγούς της δομής, του μοριακού της βάρους και του ισοηλεκτρικού της σημείου. Το μοριακό βάρος του ενζύμου εξακριβώθηκε μέσω Ηλεκτροφόρησης Γέλης Πολυακρυλαμιδίου (SDS-PAGE), και πραγματοποιήθηκαν πειράματα για την εύρεση του βέλτιστου pH και θερμοκρασίας του ενζύμου. Έπειτα, πραγματοποιήθηκαν πειράματα για την εξακρίβωση του συνεργητισμού της FoLPMO9A με άλλα ένζυμα, όπως την αύξηση της απόδοσης ενζυμικής αποικοδόμησης της λιγνοκυτταρινούχου βιομάζας παρουσίας κυτταρινασών, και την διευκρίνιση του συνεργητισμού μεταξύ LPMOs των οικογενειών ΑΑ9 και AA16. Τέλος, διερευνήθηκε η ικανότητα τροποποίησης υποστρωμάτων κυτταρίνης της FoLPMO9A ως πιθανή βιοτεχνολογική εφαρμογή του ενζύμου. Η FoLPMO9A εφαρμόστηκε σε βακτηριακή νανοκυτταρίνη, και το υπόστρωμα ελέγχθηκε για τροποποιήσεις μέσω των τεχνικών Ηλεκτρονικής Μικροσκοπίας Σάρωσης (SEM) και Φασματοσκοπίας Υπερύθρου Μετασχηματισμού Fourier (FTIR).	el
heal.abstract	The utilization of non-renewable resources as an energy source has been linked with multiple adverse environmental effects, such as the phenomena of climate change. The utilization of lignocellulosic biomass has been proposed as an alternative to conventional petrochemicals, however its recalcitrance proves to be a major obstacle in its utilization. This recalcitrance is partly due to the crystallinity of cellulose, which is unable to be decomposed by hydrolytic cellulase enzymes. Fungal systems capable of completely degrading lignocellulose potentially hold the key to effective utilization of the substrate. Among such systems, enzymes referred to as Lytic Polysaccharide Monooxygenases (LPMOs) have been identified, unique due to their capability to degrade crystalline cellulose by oxidizing the glycosidic bond, utilizing molecular oxygen or hydrogen peroxide as a co-substrate. The oxidative action of LPMOs creates new points for the hydrolytic cellulases to act, thus increasing the overall yield of the process. LPMOs have been divided into 8 families by the enzyme database CAZy (Carbohydrate Active Enzymes), based on the similarity of their amino acid sequences. In the following thesis, a novel LPMO of the family AA9 is characterized, first identified from the microorganism Fusarium oxysporum, and specifically the strain FΟ47, named FoLPMO9A. The protein was expressed heterologously utilizing Pichia pastoris as the expression system and purified utilizing Immobilized Metal Affinity Chromatography (IMAC). The enzyme’s activity was measured using High Performance Anion Exchange Chromatography with Pulsed Amperometric Detection (HPAE-PAD) to detect the soluble oxidized oligosaccharides that were released. Bioinformatics tools were first utilized to predict the properties of the enzyme, including its tertiary structure, molecular weight and its isoelectric point. The enzyme’s molecular weight was identified through Polyacrylamide Gel Electrophoresis (SDS-PAGE), and experiments were conducted to detect the enzyme’s optimal pH and temperature. Additionally, experiments were conducted to determine its synergism with other enzymes, including its ability to boost the production of sugar when paired with hydrolytic cellulases, and the boosting effect that occurs when pairing LPMOs of the AA9 and AA16 families. Finally, FoLPMO9A’s ability to modify cellulose substrates was investigated as a potential biotechnological application. FoLPMO9A was applied to bacterial nanocellulose, and changes to the substrate were identified utilizing Scanning Electron Microscopy (SEM) and Fourier Transform Infrared Spectroscopy (FTIR).	en
heal.advisorName	Τόπακας, Ευάγγελος	el
heal.advisorName	Topakas, Evangelos	en
heal.committeeMemberName	Τόπακας, Ευάγγελος	el
heal.committeeMemberName	Topakas, Evangelos	en
heal.committeeMemberName	Μαμμά, Διομή	el
heal.committeeMemberName	Mamma, Diomi	en
heal.committeeMemberName	Λαμπρόπουλος, Κυριάκος	el
heal.committeeMemberName	Lampropoulos, Kyriakos	en
heal.academicPublisher	Εθνικό Μετσόβιο Πολυτεχνείο. Σχολή Χημικών Μηχανικών. Τομέας Σύνθεσης και Ανάπτυξης Βιομηχανικών Διαδικασιών (IV). Εργαστήριο Βιοτεχνολογίας	el
heal.academicPublisherID	ntua
heal.numberOfPages	86 σ.	el
heal.fullTextAvailability	false