Ανακάλυψη και χαρακτηρισμός θερμόφιλων ΜΗΕΤασών

Παπουτσά, Αντωνία; Papoutsa, Antonia

dc.contributor.author	Παπουτσά, Αντωνία	el
dc.contributor.author	Papoutsa, Antonia	en
dc.date.accessioned	2025-04-28T07:58:47Z
dc.identifier.uri	https://dspace.lib.ntua.gr/xmlui/handle/123456789/61782
dc.identifier.uri	http://dx.doi.org/10.26240/heal.ntua.29478
dc.rights	Default License
dc.subject	Πλαστικά	el
dc.subject	Τερεφθαλικό πολυαιθυλένιο	el
dc.subject	Βιοαποικοδόμηση	el
dc.subject	MHET	el
dc.subject	Θερμοανθεκτική MHETase	el
dc.subject	Ετερόλογη έκφραση	el
dc.title	Ανακάλυψη και χαρακτηρισμός θερμόφιλων ΜΗΕΤασών	el
heal.type	bachelorThesis
heal.classification	Biotechnology	en
heal.dateAvailable	2026-04-27T21:00:00Z
heal.language	el
heal.access	embargo
heal.recordProvider	ntua	el
heal.publicationDate	2024-09-15
heal.abstract	Το τερεφθαλικό πολυαιθυλένιο (PET), είναι το πιο ανακυκλώσιμο πλαστικό παγκοσμίως, ωστόσο οι συμβατικές μέθοδοι ανακύκλωσης του παρουσιάζουν αρκετά προβλήματα, τόσο από περιβαλλοντική όσο και από οικονομική άποψη. Την τελευταία δεκαετία, έχει ανακαλυφθεί μια πληθώρα ενζύμων που συμμετέχουν στην υδρόλυση του PET, διασπώντας το στα μονομερή του, δηλαδή το τερεφθαλικό οξύ (TPA) και την αιθυλενογλυκόλη (EG). Ωστόσο, η καταλυτική δράση τους αναστέλλεται από τον σχηματισμό του μονο-(2- υδροξυαιθυλο) τερεφθαλικού (MHET), το ολιγομερές του PET. Η βέλτιστη θερμοκρασία για την ενζυμική αποδόμηση του PET είναι κοντά στη θερμοκρασία υαλώδους μετάπτωσης του (70 °C), καθώς σε αυτή τη θερμοκρασία οι άμορφες περιοχές του PET γίνονται πιο εύκολα προσβάσιμες στα ένζυμα, διευκολύνοντας την αποικοδόμησή του. Ενώ υπάρχουν PETάσες και άλλες εστεράσες που αντέχουν σε αυτές τις θερμοκρασίες, δεν υπάρχουν πολλές αναφορές θερμοσταθερών MHETασών, οι οποίες να ταιριάζουν και να δρουν συνεργιστικά με κάποια PET υδρολάση θερμοκρασία άνω των 50 °C. Στη παρούσα ερευνητική μελέτη, υποψήφιες θερμοανθεκτικές MHETάσες εντοπίστηκαν μέσω των βιοπληροφορικών εργαλείων BLAST και ThermoProt. Η επιλογή βασίστηκε στην ομοιότητα με την καλά μελετημένη IsMHETase από την Ideonella sakaiensis, στον προβλεπόμενο τύπο έκκρισης και στη προβλεπόμενη θερμοφιλικότητα του ενζύμου. Οι πιο υποσχόμενοι υποψήφιοι ήταν η ZcMHETase από την Zhizhongheella caldifontis, και η BbMHETase από το Burkholderiales bacterium. Τα συνθετικά γονίδια εισήχθησαν σε πλασμιδιακούς φορείς (pET-26b(+)) και εκφράστηκαν ετερόλογα σε επιδεκτικά κύτταρα Escherichia coli Shuffle T7. Εκφράστηκε και απομονώθηκε με επιτυχία η ZcMHETase (59 kDa), καθώς και οι μεταλλάξεις τις που σχεδιάστηκαν κατ’ομολογία με την IsMHETase, G108S, N194E και L354F. Έπειτα από βιοχημικό χαρακτηρισμό της ZcMHETase προσδιορίστηκε η βέλτιστη θερμοκρασία δράσης της, Τoptimum=60°C. Μελέτη θερμοσταθερότητας του ενζύμου έδειξε πως διατηρεί σχεδόν το 100% της ενεργότητας της έπειτα από 24 ώρες επώασης σε ένα θερμοκρασιακό εύρος 40-55°C, ενώ στους 60 °C φαίνεται να μην είναι σταθερή, έχοντας χάσει το 80% της αρχικής ενεργότητας της στη πρώτη ώρα επώασης. Η θερμοκρασία τήξης της προσδιορίστηκε μέσω Διαφορικής Φθοριομετρίας Σάρωσης (DSF), και είναι ίση με Tm=58.72±0.29 °C. Για τις μεταλλάξεις G108S, L354F και N194E η Tm προσδιορίστηκε ίση με 59.99±0.25, 63.43±0.47 και 53.66±0.14 °C αντίστοιχα, υποδηλώνοντας ότι οι σημειακές μεταλλάξεις G108S και L354F ενισχύουν το θερμοανθεκτικό χαρακτήρα της ZcMHETase. Η θερμοκρασία τήξης της IsMHETase είναι 54.19±0.08 °C επιβεβαιώνοντας ότι η ZcMHETase είναι πιο θερμοσταθερή. Ύστερα από αντίδραση με το MHET, διαπιστώθηκε πως η ZcMHETase δρα βέλτιστα σε ένα εύρος από 5 έως και 7, ενώ σε αλκαλικές συνθήκες φαίνεται να μειώνεται απότομα η δραστικότητα της. Αντίθετα, οι σημειακές μεταλλάξεις G108S, L354F και N194E, φαίνεται να μειώνουν την καταλυτική ικανότητα της στην υδρόλυση του MHET. Η μελέτη αυτή επέφερε αρκετά ενθαρρυντικά αποτελέσματα. Με περεταίρω μελέτη του ενζύμου, η ZcMHETase θα μπορούσε τελικά να χρησιμοποιηθεί ως νέα βάση για τον σχεδιασμό πιο αποδοτικών ενζυμικών συστημάτων αξιοποίησης και ανακύκλωσης του PET.	el
heal.advisorName	Τόπακας, Ευάγγελος	el
heal.committeeMemberName	Νικολάιβιτς, Ευστράτιος	el
heal.committeeMemberName	Τσακανίκας, Άγγελος	el
heal.academicPublisher	Εθνικό Μετσόβιο Πολυτεχνείο. Σχολή Χημικών Μηχανικών. Τομέας Σύνθεσης και Ανάπτυξης Βιομηχανικών Διαδικασιών (IV). Εργαστήριο Βιοτεχνολογίας	el
heal.academicPublisherID	ntua
heal.numberOfPages	118 σ.	el
heal.fullTextAvailability	false