Μελέτη συνδυαστικής δράσης κυτταρινολυτικών και ημικυτταρινολυτικών ενζύμων με στόχο την αποδοτική αποικοδόμηση λιγνινοκυτταρινούχου βιομάζας

Καραμήτρου, Μαριάννα Στυλιανή

dc.contributor.author	Καραμήτρου, Μαριάννα Στυλιανή	el
dc.date.accessioned	2025-05-05T10:40:17Z
dc.date.available	2025-05-05T10:40:17Z
dc.identifier.uri	https://dspace.lib.ntua.gr/xmlui/handle/123456789/61857
dc.identifier.uri	http://dx.doi.org/10.26240/heal.ntua.29553
dc.rights	Αναφορά Δημιουργού-Μη Εμπορική Χρήση-Όχι Παράγωγα Έργα 3.0 Ελλάδα	*
dc.rights.uri	http://creativecommons.org/licenses/by-nc-nd/3.0/gr/	*
dc.subject	Λιγνινοκυτταρινούχος βιομάζα	el
dc.subject	Ενζυμική υδρόλυση	el
dc.subject	Ημικυτταρινολυτικά μίγματα	el
dc.subject	Συνεργητισμός ενζύμων	el
dc.subject	Υπομονάδα πρόσδεσης πολυσακχαριτών	el
dc.subject	Lignocellulosic biomass	en
dc.subject	Enzymatic hydrolysis	en
dc.subject	Hemicellulolytic cocktails	en
dc.subject	Enzyme synergy	en
dc.subject	Carbohydrate-binding module	en
dc.title	Μελέτη συνδυαστικής δράσης κυτταρινολυτικών και ημικυτταρινολυτικών ενζύμων με στόχο την αποδοτική αποικοδόμηση λιγνινοκυτταρινούχου βιομάζας	el
dc.title	Combined activity of cellulolytic and hemicellulolytic enzymes for the efficient degradation of lignocellulosic biomass	en
dc.contributor.department	Τομέας Σύνθεσης και Ανάπτυξης Βιομηχανικών Διαδικασιών-Εργαστήριο Βιοτεχνολογίας	el
heal.type	bachelorThesis
heal.classification	Βιομηχανική Βιοτεχνολογία	el
heal.classification	Industrial Biotechnology	en
heal.language	el
heal.access	free
heal.recordProvider	ntua	el
heal.publicationDate	2024-10-04
heal.abstract	Η λιγνινοκυτταρινούχος βιομάζα αποτελεί μια ανανεώσιμη πρώτη ύλη που δύναται να αξιοποιηθεί για την παραγωγή βιοκαυσίμων δεύτερης γενιάς και βιο-προϊόντων υψηλής προστιθέμενης αξίας. Εστιάζοντας στην ανάγκη για εφαρμογή στρατηγικών βιώσιμης ανάπτυξης, η αποικοδόμηση της βιομάζας προσανατολίζεται σε φιλικές προς το περιβάλλον τεχνικές, όπως η διεργασία της ενζυμικής υδρόλυσης. Η συγκεκριμένη διεργασία πραγματοποιείται σε ήπιες συνθήκες θερμοκρασίας και πίεσης και συνεπακόλουθα, έχει μικρότερες ενεργειακές απαιτήσεις, ενώ παράλληλα επιτυγχάνει υψηλές τελικές αποδόσεις, λόγω της εξειδικευμένης δράσης των ενζύμων. Ωστόσο, η ετερογενής δομή της λιγνινοκυτταρίνης, η οποία συνίσταται από ένα πολύπλοκο δίκτυο κυτταρίνης, ημικυτταρίνης και λιγνίνης, δημιουργεί σημαντικούς περιορισμούς στην αξιοποίησή της. Συνεπώς, για την αποτελεσμα-τικότερη δράση στην βιομάζα, απαιτείται ένας συνδυασμός διαφορετικών ενζύμων που αποικοδομούν επιλεκτικά καθένα από τα δομικά συστατικά της. Στην συγκεκριμένη διπλωματική εργασία μελετήθηκε η ενεργότητα κύριων και βοηθητικών ενζύμων, κατά τη σύνθεση πολυσυστατικών ενζυμικών μιγμάτων, ως προς την σακχαροποίηση πολυμερικών δομών της βιομάζας, αξιοποιώντας διαφορετικά προκατεργασμένα λιγνινοκυτταρινούχα υποστρώματα. Αρχικά, χρησιμοποιώντας ως βάση την διλειτουργική γλυκουρονοξυλανάση/ ξυλοβιοϋδρολάση TtXyn30A, διερευνήθηκε η δράση της σε συνδυασμό με εστεράσες του οξικού οξέος (TtCE16B και OCE6) και εμπορικό κυτταρινολυτικό σκεύασμα (Cellic® CTec2), με την προσθήκη β-ξυλοζιδασών (SrXyl43 και RcXyl39) και αραβινο-φουρανοζιδασών (TtAbf43 και AnAbf51) σε υποστρώματα προκατεργασμένου ξύλου οξιάς και υπολειμμάτων αραβοσίτου. Ο συνδυασμός του ημικυτταρινολυτικού κοκτέιλ με το εμπορικό κυτταρινολυτικό παρασκεύασμα Cellic, αύξησε σημαντικά την απελευθέρωση ξυλοβιόζης και γλυκόζης. Η προσθήκη της ξυλοζιδάσης SrXyl43 στο ημικυτταρινολυτικό μίγμα επέφερε αύξηση στην απελευθέρωσης της ξυλόζης (βαθμός συνεργητισμού 1,3±0,0), ενώ με την παρουσία του Cellic® CTec2 ο βαθμός συνεργητισμού άγγιξε το 1,9±0,2 για το υπόστρωμα ξύλου οξιάς. Αντιστοίχως, η προσθήκη των αραβινοφουρανοζιδασών αύξησε την απελευθέρωση ξυλόζης στο ημικυτταρινολυτικό κοκτέιλ από 75±5μM σε 220±7μM, ενώ ακόμα πιο έντονη ήταν η επίδρασή τους στο κυτταρινολυτικό μίγμα Cellic (βαθμός συνεργητισμού 2,5±0,1), με παράλληλη απελευθέρωση αραβινόζης από το υπόστρωμα αραβοσίτου. Στην συνέχεια, διερευνήθηκαν φαινόμενα συνεργητισμού μεταξύ βοηθητικών ενζυμικών δράσεων και του ημικυτταρινολυτικού κοκτέιλ. Για αυτόν τον σκοπό, εξετάστηκε ο συνεργητισμός μεταξύ της ξυλανάσης TtXyn30A, της αραβινο-φουρανοζιδάσης TtAbf43 και της εστεράσης του φερουλικού οξέος FoFAE, με την προσθήκη της λυτικής μονοοξυγενάσης πολυσακχαριτών ΑΑ9 σε διαφορετικά προ-κατεργασμένα υποστρώματα. Ο συγκεκριμένος ημικυτταρινολυτικός συνδυασμός ενίσχυσε σημαντικά της δράση της ξυλανάσης παρουσιάζοντας βαθμούς συνεργητισμού μεγαλύτερους από 2,5±0,8. Η προσθήκη της ΑΑ9 είχε επίσης συνεργητικό αποτέλεσμα με τη TtXyn30A με βαθμό 1,3±0,0 κατά την απελευθέρωση ξυλοβιόζης, ενώ ο συνδυασμός της με το πλήρες ημικυτταρινολυτικό μίγμα επέφερε αύξηση στην απελευθέρωση αναγωγικών σακχάρων από 0,08±0,02mg/mL σε 0,20±0,01mg/mL. Έπειτα, η μελέτη εστιάστηκε στον συνδυασμό ξυλανασών (TtXyn30A και TmXyn10) με εστεράσες του γλυκουρονικού οξέος (AeGE15, TlGE15 και StGE15), επιχειρώντας την ταυτόχρονη εφαρμογή τεχνικών τροποποίησης της δομής της λιγνίνης, η οποία δρα παρεμποδιστικά στην υδρόλυση. Ειδικότερα, χρησιμοποιήθηκαν ένζυμα που τροποποιούν τη λιγνίνη (υπεροξειδάση, λακκάση), αλλά και ουσίες που αλληλεπιδρούν με την επιφάνειά της, όπως BSA και Tween 80 για τον περιορισμό της μη παραγωγικής δέσμευσης των ενζύμων. Τα βέλτιστα αποτελέσματα παρατηρήθηκαν από την διαδοχική δράση της υπεροξειδάσης ή της λακκάσης ως μορφή προκατεργασίας του υποστρώματος, συγκριτικά με την ταυτόχρονη δράση τους με το ημικυτταρινολυτικό μίγμα. Η TtXyn30A φανέρωσε χαμηλή συνεργητική δράση με την StGE15 σε προκατεργασμένο με λακκάση υπόστρωμα και μικρή ενίσχυση με υπεροξειδάση. Αντιστοίχως, η ξυλανάση TmXyn10 απέδωσε αυξημένη απελευθέρωση αναγωγικών σακχάρων σε κάθε συνδυασμό εστερασών για όλα τα προκατεργασμένα υποστρώματα. Ωστόσο, η προσθήκη BSA και Tween 80 δεν ενίσχυσε την υδρολυτική ικανότητα του ημικυτταρινολυτικού μίγματος. Επομένως, παρατηρήθηκε πως η εξειδίκευση της κάθε ξυλανάσης προώθησε διαφορετικά συνεργητικά φαινόμενα και η δράση των εστερασών του γλυκουρονικού οξέος ήταν περιορισμένη, χωρίς να επηρεάζεται σε μεγάλο βαθμό από την λιγνίνη. Τέλος, χρησιμοποιήθηκαν βιοπληροφορικά εργαλεία για την ανάλυση της υπομονάδας πρόσδεσης πολυσακχαριτών CBM1 των εστερασών του γλυκουρονικού οξέος AeGE15 και TlGE15, συγκρίνοντας με αλληλουχίες CBM1 βακτηριακών και μυκητιακών πρωτεϊνών, καθώς και με χαρακτηρισμένες δομές για την πρόβλεψη της δράσης τους. Διαπιστώθηκε ότι τα αμινοξέα του CBM1 που είναι υπεύθυνα για την πρόσδεση του στην κυτταρίνη (τρεις τυροσίνες που στηρίζονται πλευρικά από μία γλουταμίνη και μία ασπαραγίνη), είναι σε μεγάλο ποσοστό πανομοιότυπα και διατηρούνται πλήρως ή μερικώς σε κάθε αλληλουχία που μελετήθηκε. Έτσι, ενδέχεται τα CBM1 των μελετούμενων εστερασών του γλυκουρονικού οξέος να προσδένονται και στην κυτταρίνη, πέραν της λιγνίνης, με παρεμποδιστική επίδραση. Στην παρούσα διπλωματική εργασία, λοιπόν, διερευνήθηκαν κυτταρινολυτικές και ημικυτταρινολυτικές δράσεις, οι οποίες συνεισέφεραν σε διαφορετικό βαθμό στην αποικοδόμηση διαφορετικών υποστρωμάτων, παρέχοντας πολύτιμες ενδείξεις για την εφαρμογή συνεργητικών ενζυμικών κοκτέιλ σε βιοδιεργασίες αξιοποίησης της λιγνινοκυτταρινούχου βιομάζας. Αναδείχθηκε νέα πληροφορία αναφορικά με συνεργητικές δράσεις ενζύμων σε δείγματα προκατεργασμένης λιγνινο-κυτταρινούχου βιομάζας, αξιοποιώντας και μελετώντας καινοτόμες ενζυμικές ενεργότητες. Παράλληλα, μελετήθηκε η επίδραση της λιγνίνης στις συνεργητικές σχέσεις των εστερασών του γλυκουρονικού οξέος και αναδείχθηκαν βιοπληροφορικά δεδομένα που ορίζουν νέες κατευθύνσεις για περαιτέρω έρευνα σε αυτόν τον τομέα.	el
heal.abstract	Lignocellulosic biomass is a renewable raw material that can be used for the production of second-generation biofuels and high value-added bio-products. Focusing on the need to implement sustainable development strategies, the degradation of biomass is oriented towards environmentally friendly techniques such as the enzymatic hydrolysis process. This process is carried out under mild conditions of temperature and pressure and, consequently, has lower energy requirements, while achieving high final yields due to the specific action of enzymes. However, the heterogeneous structure of lignocellulose, which consists of a complex network of cellulose, hemicellulose and lignin, poses significant limitations to its utilisation. Therefore, for the most effective action on the biomass, a combination of different enzymes is required, that selectively degrade each of its structural components. In this thesis, the activity of main and auxiliary enzymes was studied, during the synthesis of multicomponent enzyme mixtures, in terms of saccharification of biomass polymeric structures, utilizing different pretreated lignocellulosic substrates. Initially, the activity of the bifunctional glucuronoxylanase/xylobiohydrolase TtXyn30A was investigated in combination with acetic acid esterases (TtCE16B and OCE6) and a commercial cellulolytic mixture (Cellic® CTec2), with the addition of β-xylosidases (SrXyl43 and RcXyl39) and arabinofuranosidases (TtAbf43 and AnAbf51) on substrates of pretreated beechwood and corn bran. The combination of the hemicellulolytic cocktail with the commercial cellulolytic mixture Cellic, significantly increased xylobiose and glucose release. The addition of SrXyl43 xylosidase to the hemicellulolytic mixture resulted in an increase in xylose release (degree of synergism 1.3±0.0), while in the presence of Cellic® CTec2 the degree of synergism reached 1.9±0.2 for the beechwood substrate. Correspondingly, the addition of arabinofuranosidases increased the xylose release in the hemicellulolytic cocktail from 75±5μM to 220±7μM, while their effect was even more pronounced in the Cellic cellulolytic mixture (degree of synergism 2.5±0.1), with a parallel release of arabinose from the corn bran substrate. Subsequently, synergistic interactions between auxiliary enzymatic activities and the hemicellulolytic cocktail were investigated. For this purpose, synergism between TtXyn30A xylanase, TtAbf43 arabinofuranosidase and FoFAE ferulic acid esterase was studied, with the addition of the lytic polysaccharide monooxygenase AA9 to different pretreated substrates. This hemicellulolytic combination significantly enhanced the xylanase activity showing degrees of synergism greater than 2.5±0.8. The addition of AA9 also had a synergistic effect with TtXyn30A with a degree of 1.3±0.0 upon xylobiose release, while its combination with the hemicellulolytic mixture resulted in an increased release of reducing sugars from 0.08±0.02 mg/mL to 0.20±0.01 mg/mL. Furthermore, the study focused on the combination of xylanases (TtXyn30A and TmXyn10) with glucuronoyl esterases (AeGE15, TlGE15 and StGE15), attempting to simultaneously apply techniques to modify the structure of lignin, which acts as an inhibitor of hydrolysis. In particular, lignin-modifying enzymes (peroxidase, laccase), but also lignin-blockers that interact with its surface, such as BSA and Tween 80, were used to limit the non-productive binding of the enzymes. Optimal results were observed from the sequential action of peroxidase or laccase as a form of substrate pretreatment, compared to their simultaneous action with the hemicellulolytic mixture. TtXyn30A showed low synergistic activity with StGE15 on laccase pretreated substrate and a slight enhancement with peroxidase. Similarly, TmXyn10 xylanase yielded increased release of reducing sugars in each esterase combination for all pretreated substrates. However, the addition of BSA and Tween 80 did not enhance the hydrolytic capacity of the hemicellulolytic mixture. Therefore, it was observed that the specificity of each xylanase promoted different synergistic effects and the activity of glucuronoyl esterases was limited, without being greatly affected by lignin modification or pretreatment. Finally, bioinformatics tools were used in order to analyze the CBM1 carbohydrate-binding module of the glucuronoyl esterases AeGE15 and TlGE15, comparing with CBM1 sequences of bacterial and fungal proteins, as well as with characterized structures to predict their activity. It was found that the amino acids of CBM1 responsible for its binding to cellulose (three tyrosines supported laterally by a glutamine and an asparagine) are highly identical and fully or partially conserved in each sequence studied. Thus, it is possible that the CBM1s of the studied glucuronoyl esterases bind to cellulose, in addition to lignin, with an inhibitory effect. In this thesis, therefore, cellulolytic and hemicellulolytic activities were investigated, that contributed to different degrees to the degradation of different substrates, providing valuable information for the application of synergistic enzyme cocktails in lignocellulosic biomass utilization bioprocesses. Therefore, new information regarding synergistic enzyme activities in pretreated lignocellulosic biomass samples was highlighted by exploiting and studying novel enzyme activities. At the same time, the effect of lignin on the synergistic relationships of glucuronoyl esterases was studied and bioinformatic data were highlighted, setting new directions for further research in this area.	en
heal.advisorName	Τόπακας, Ευάγγελος	el
heal.committeeMemberName	Κορδάτος, Κωνσταντίνος	el
heal.committeeMemberName	Νικολάιβιτς, Ευστράτιος	el
heal.academicPublisher	Εθνικό Μετσόβιο Πολυτεχνείο. Σχολή Χημικών Μηχανικών. Τομέας Σύνθεσης και Ανάπτυξης Βιομηχανικών Διαδικασιών (IV). Εργαστήριο Βιοτεχνολογίας	el
heal.academicPublisherID	ntua
heal.numberOfPages	115 σ.	el
heal.fullTextAvailability	false