Ετερόλογη έκφραση και χαρακτηρισμός μιας GH61 οξειδάσης από το Sporotrichum thermophile

Abstract

Τα λιγνινοκυτταρινούχα υλικά αποτελούν μια άφθονη και ανανεώσιμη πηγή σακχαρούχων υποστρωμάτων που μπορούν να υδρολυθούν και να υποστούν ζύμωση για μετατροπή τους σε αιθανόλη. Έτσι χρησιμοποιώντας λιγνινοκυτταρικά υλικά όπως τα γεωργικά κατάλοιπα, δασοκομικά και αστικά απόβλητα τα οποία αποτελούν περίπου το 50% της παγκόσμιας βιομάζας, μπορεί να μειωθεί σημαντικά το κόστος των πρώτων υλών για την παραγωγή βιοαιθανόλης. Η βιοαιθανόλη παράγεται από τη ζύμωση των σακχάρων με τη βοήθεια μικροοργανισμών που αποδομούν τη φυτική βιομάζα σε ολιγοσακχαρίτες. Οι μικροοργανισμοί αυτοί καθώς και τα ένζυμα που παράγουν παρουσιάζουν συνεπώς αυξημένο ενδιαφέρον για βιοτεχνολογικές εφαρμογές. Ο σκοπός της παρούςας εργασίας ήταν η ετερόλογη έκφραση και ο χαρακτηρισμός μιας GH61 οξειδάσης από το Sporotrichum thermophile. Η έρευνα αυτη εντάσσεται σε μια προσπάθεια κατανόησης της υψηλής απόδοσης με την οποία υδρολύουν το φυτικό κυτταρικό τοίχωμα οι κυταρρινολυτικοί μύκητες. Κατ'επέκταση, σκοπός ήταν επίσης η χρήση της γνώσης αυτής για τη μείωση του ενζυμικού φορτίου που απαιτείται για την υδρόλυση των λιγνινοκυτταρινούχων υλικών σε βιομηχανικό επίπεδο. Συγκεκριμένα χαρακτηρίστθκε μια πρωτεΐνη τησ οικογενείας 61 της βάσης δεδομένων CAZy (Carbohydrate Active enzymes Database). Η πρωτεΐνη που μελετήθηκε προερχόταν από το μύκητα Sporotrichum thermophile (StCel61) και εκφράστηκε στη μεθυλότροφη ζύμη Pichia pastoris. Χαρακτήρίστηκε ως προς τη σταθερότητα της σε ένα εύρος θερμοκρασιών και pH, προσδιορίστηκαν οι βέλτιστες συνθήκες δράσης καθώς και εξετάστηκε η ικανότητα της να υδρολύει ποικιλία πολυσακχαριτών

Lignocellulosic materials are the most abundant and renewable sources of saccharide substrates that can be hydrolyzed and fermented to ethanol. Thus, the use of lignocellulosic materials such as agricultural residues, forestry and urban wastes which constitute about 50% of the global biomass can significantly reduce the cost of raw materials for bioethanol production. Bioethanol is produced from the fermentation of sugars with the aid of microorganisms which degrade the plant biomass into oligosaccharides. These microorganisms and their enzymes present therefore an increased interest for biotechnological applications. The purpose of this study was the heterologous expression and characterization of a GH61 oxidase from Sporotrichum thermophile. This research is part of an effort to understand the high efficiency of this cellulolytic fungus in hydrolyzing the plant cell wall. The goal of this study was also to use this knowledge to reduce the amount of enzymes required for the hydrolysis of lignocellulosic materials at industrial level. Specifically, a protein of the family 61 from the database CAZy (Carbohydrate Active enzymes Database) was studied. The corresponding gene was isolated from S. thermophile genomic DNA and incorporated in methylotrophic yeast Pichia pastoris genome for expression. Its stability was determined in a range of temperatures and pH. The study also allowed the determination of optimal activity conditions (T and pH) and of the enzyme ability to hydrolyze a variety of polysaccharides.