Σύνθεση καινοτόμων υποστρωμάτων για το χαρακτηρισμό εστερασών του γλυκουρονικού οξέος

Abstract

Στην παρούσα διπλωματική εργασία μελετήθηκε η δράση της εστεράσης του γλυκουρονικού οξέος από το θερμόφιλο μύκητα Sporotrichum thermophile σε συνθετικά ανάλογα των φυσικών υποστρωμάτων και πιο συγκεκριμένα σε φαινυλεστέρες του γλυκουρονικού οξέος. Αρχικά, πραγματοποιήθηκε παραγωγή και απομόνωση της ανασυνδυασμένης πρωτεΐνης StGE2 από μετασχηματισμένα κύτταρα του ζυμομύκητα P. pastoris. Η παραγωγή πραγματοποιήθηκε με υγρές καλλιέργειες των κυττάρων της ζύμης, η απομόνωση έγινε με στάδια διηθήσεων, συμπύκνωσης και χρωματογραφίας συγγένειας ακινητοποιημένου μετάλλου (IMAC) και τέλος το μοριακό βάρος της πρωτεΐνης προσδιορίστηκε μέσω ηλεκτροφόρησης πηκτής πολυακρυλαμιδίου (SDS-PAGE) στα 43 kDa. Στη συνέχεια ακολούθησε η ενζυμική σύνθεση και ο καθαρισμός τριών εστέρων του D-γλυκουρονικού οξέος της 3-φαινυλ-1-προπανόλης, της κινναμικής αλκοόλης και της 3-(4-υδροξυφαινυλ)-1-προπανόλης. Η σύνθεση των εστέρων πραγματοποιήθηκε ενζυμικά χρησιμοποιώντας ως βιοκαταλύτη τη λιπάση Novozym 435, ο καθαρισμός έγινε με εκχύλιση και χρωματογραφία πηκτής διοξειδίου του πυριτίου (silica gel chromatography), ενώ η ταυτοποίηση των εστέρων πραγματοποιήθηκε μέσω φασματοσκοπίας πυρηνικού μαγνητικού συντονισμού (NMR). Η κινητική μελέτη της δράσης της εστεράσης του γλυκουρονικού οξέος StGE2 στα συνθετικά υποστρώματα οδήγησε στον υπολογισμό των σταθερών Michaelis-Menten Km και kcat, καθώς και του λόγου kcat / Km ο οποίος αποτελεί ένδειξη για την προτίμηση του ενζύμου ως προς το υπόστρωμα. Ο υπολογισμός πραγματοποιήθηκε με ποσοτικό προσδιορισμό της απελευθέρωσης των φαινολικών αλκοολών 3-φαινυλ-1-προπανόλη, κινναμική αλκοόλη και 3-(4-υδροξυφαινυλ)-1-προπανόλη κατά την υδρόλυση των υποστρωμάτων από την StGE2 με υγρή χρωματογραφία υψηλής απόδοσης (HPLC). Για το σκοπό αυτό καταστρώθηκε αναλυτική μέθοδος HPLC όπου με δοκιμές προέκυψε ο κατάλληλος διαλύτης έκλουσης και έπειτα κατασκευάστηκαν οι καμπύλες αναφοράς των αλκοολών. Από την σύγκριση του λόγου kcat / Km μεταξύ των υποστρωμάτων προσδιορίσθηκε ότι ο εστέρας της κινναμικής αλκοόλης υδρολύεται ταχύτερα χωρίς όμως η εστεράση να επιδεικνύει υψηλή συγγένεια ως προς τα υποστρώματα. Τέλος, για την παραγωγή νέων συνθετικών υποστρωμάτων τα οποία να βρίσκονται πιο κοντά στα φυσικά, έγινε προσπάθεια απομόνωσης 4-Ο-μεθυλ-D-γλυκουρονικού οξέος από γλυκουρονοξυλάνη σημύδας προκειμένου να χρησιμοποιηθεί ως αντιδρόν στις ενζυμικές συνθέσεις των φαινυλεστέρων αντί του D-γλυκουρονικού οξέος. Για πρώτη φορά, πραγματοποιήθηκε κινητική μελέτη της δράσης μιας εστεράσης του γλυκουρονικού οξέος σε φαινολικούς εστέρες του αντίστοιχου οξέος συμβάλλοντας έτσι στην προσπάθεια διαλεύκανσης του ρόλου αυτών των ενζύμων στην αποικοδόμηση των φυτικών κυτταρικών τοιχωμάτων.

The present diploma thesis examines the action of a glucuronoyl esterase from the thermophilic fungus Sporotrichum thermophile on three synthetic compounds that mimic the ester linkages of natural substrates and more specifically on esters of D-glucuronic acid with phenyl alcohols. Recombinant glucuronoyl esterase StGE2 was produced in Pichia pastoris using liquid cell cultures. For the purification of the recombinant protein, culture broth was centrifuged, filtrated and concentrated and subsequently the protein was purified using immobilized metal-ion affinity chromatography (IMAC). Both the homogeneity and the molecular weight of the purified StGE2 were assessed by sodium dodecyl sulphate-polyacrylamide electrophoresis (SDS-PAGE) with the latter estimated to be 43 kDa. Esters of D-glucuronic acid with 3-phenyl-1-propanol, cinnamyl alcohol and 3-(4-hydroxyphenyl)-1-propanol were prepared by using immobilized Candida antarctica Lipase B in organic medium. The glucuronates, containing a UV-absorbing chromophore, were purified by filtration, extraction and silica gel chromatography and characterized by nuclear magnetic resonance spectroscopy (NMR). The catalytic properties of the purified glucuronoyl esterase StGE2 on all three substrates were examined by determining the Km, kcat and kcat/Km values. The determination of kinetic parameters was carried out on all esters by using a quantitative assay which was based on the measurement of the increase of phenyl alcohols by following the enzymatic de-esterification by high performance liquid chromatography (HPLC) coupled with a spectrophotometric detector. The elution solvent was determined through trials and alcohols standard curves were prepared by using the same assay. The StGE2 exhibited higher affinity and catalytic efficiency for cinnamyl glucuronate than for the other esters. For the synthesis of new, more specialized substrates, purification of 4-O-methyl-D-glucuronic acid from birch glucuronoxylan was carried out in order to take the place of D-glucuronic acid as reactant in enzymatic esterification with each of the three phenyl alcohols. This is the first time that a glucuronoyl esterase’s kinetic action on phenyl esters of D-glucuronic acid is examined, making a step towards the unraveling of such enzymes’ role in plant cell wall degradation.