Μελέτη αλλοιώσεων στο DNA καρκινικών κυττάρων MCF7 κατόπιν ακτινοβόλησης και χρήσης του αναστολέα NU7026

Abstract

Οι βλάβες στο DNA των κυττάρων διακρίνονται από ποικιλία και κυμαινόμενη πολυπλοκότητα. Οι πιο σημαντικές από άποψη δυσκολίας επιδιόρθωσης είναι οι διπλές θραύσεις της έλικας (double strand breaks, DSBs) και τα συμπλέγματα βλαβών που δεν περιλαμβάνουν τις διπλές θραύσεις, ή αλλιώς ‘οξειδωτικώς επαγόμενες ομαδοποιημένες βλάβες DNA’ (non-DSB oxidatively-induced clustered DNA lesions, OCDLs). Λόγω της πολυπλοκότητάς τους, αυτού του είδους οι ανωμαλίες στο DNA είναι εν δυνάμει προοίμια καρκίνου, αλλά παραδόξως χρησιμοποιούνται και στην αντιμετώπισή του, για την καταστροφή καρκινικών κυττάρων. Η επιδιόρθωση των DSBs συμβαίνει κατά κύριο λόγο μέσω του μηχανισμού της μη ομόλογης επιδιόρθωσης τελικής σύνδεσης (non homologous end joining, NHEJ). Θέση-κλειδί στη διαδικασία κρατάει η DNA-εξαρτώμενη πρωτεϊνική κινάση (DNA-dependent protein kinase). Για να μελετηθεί ο ρόλος αυτής της πρωτεΐνης στην επιδιόρθωση των βλαβών σε ανθρώπινα καρκινικά κύτταρα του μαστού MCF7, χρησιμοποιήθηκε, σε συνδυασμό με ιονίζουσα ακτινοβολία (ακτίνες γ, 1 Gy), ο DNA-PK αναστολέας NU7026, ο οποίος αδρανοποιεί χημικά την DNA-PK. Η δράση του αναστολέα μελετήθηκε σε δύο επίπεδα, στο DNA με χρήση της φωσφορυλιωμένης ιστόνης γΗ2ΑΧ ως σηματοδότη και στα χρωμοσώματα των κυττάρων σε συνδυασμό με την καφεΐνη, γνωστή ουσία για την κατάργηση του σημείου ελέγχου της G2/M φάσης. Για την ανίχνευση και την ποσοτικοποίηση των βλαβών χρησιμοποιήθηκε το ανοσοϊστοχημικό πρωτόκολλο σηματοδότησης της γΗ2ΑΧ και κυτταρογενετική ανάλυση στο οπτικό μικροσκόπιο, αντίστοιχα. Σε κάθε περίπτωση, η παρεμπόδιση του επιδιορθωτικού μηχανισμού NHEJ μέσω της αδρανοποίησης της βασικής εμπλεκόμενης πρωτεΐνης DNA-PK, έδειξε συσσώρευση σημαντικού αριθμού βλαβών 24 ώρες μετά την ακτινοβόληση και συνδυασμένη, προσθετική δράση αναστολέα και καφεΐνης, αντίστοιχα. Οι πληροφορίες που προέκυψαν είναι σημαντικές για την κατανόηση της δράσης της DNA-PK και κατά συνέπεια του επιδιορθωτικού μονοπατιού NHEJ, τον ρόλο τους στην ανάπτυξη καρκίνου του μαστού, αλλά και στην βελτιστοποίηση της ραδιοθεραπείας και εξέλιξη νέων αντικαρκινικών φαρμάκων.

The damage accumulated in the genome of cells is diverse and varies in complexity. From a repair difficulty point of view, the most complex types of lesions are double strand breaks (DSBs) and non-DSB oxidatively-induced clustered DNA lesions (OCDLs). Because of their complexity, these types of aberrations in DNA are potentially cancer preludes, while paradoxically they are being used in the fight against it at the same time, to kill cancer cells. The DSB repair is mediated primarily through the non-homologous end joining pathway (NHEJ). A key protein, orchestrating this repair mechanism, is the DNA-dependent protein kinase (DNA-PK). To study the role of this particular key protein in repairing complex DNA damage induced in human breast cancer cells MCF7, we used 1 Gy of γ-irradiation combined with the action of a novel DNA-PK inhibitor, NU7026, which chemically deactivates the kinase activity of DNA-PK. The effect of the inhibitor was studied at two levels, in DNA using the phosphorylated histone γ-Η2ΑΧ as a damage marker, and in chromosomes in combination with caffeine, a well-documented abrogator of the G2/M checkpoint of the cell cycle. For the detection and the evaluation of the damage we used the immunohistochemistry protocol of γΗ2ΑΧ staining and cytogenetic analysis in the optical microscope, respectively. In any case, the NHEJ pathway blocking through the inactivation of its key protein regulator DNA-PK, showed a significant accumulation of damage 24 hrs post-irradiation, and an additive effect when combined with caffeine, respectively. The information resulting from the experiments bear great importance regarding the understanding of the DNA-PK function and consequently the NHEJ repair pathway, their implication in cancer development, but also the monitoring of radiotherapy and development of new anti-cancer drugs.