Σχεδιασμός, σύνθεση και χαρακτηρισμός δομής νέων ωρονών με συνδυασμένη βιολογική δράση

Abstract

Αυτή η διπλωματική εργασία διεξήχθη το ακαδημαϊκό έτος 2012-2013 στο Εργαστήριο Οργανικής Χημείας της Σχολής Χημικών Μηχανικών του ΕΜΠ και ασχολείται με τον σχεδιασμό, την σύνθεση και τον χαρακτηρισμό δομής νέων ωρονών με συνδυασμένη βιολογική δράση Αρχικά έγιναν προκαταρκτικές in silico μελέτες μοριακής πρόσδεσης για την εύρεση δομικών μοτίβων οργανικών ενώσεων που μπορούν να οδηγήσουν σε παρεμπόδιση του ενζύμου τυροσινάση. Λαμβάνοντας υπ’ όψιν τα αποτελέσματα αυτών των μελετών, εξήχθη το συμπέρασμα πως οι πιο πρόσφορες προς σύνθεση κατηγορίες ενώσεων ήταν οι χαλκόνες και οι ωρόνες, οι οποίες επιπλέον εμφανίζουν αξιόλογη αντιοξειδωτική δράση. Συντέθηκαν συνολικά 19 νέες ενώσεις. Οι 7 ήταν της κατηγορίας των χαλκονών (3a-g), οι οποίες συντέθηκαν μέσω αντιδράσεων συμπύκνωσης Claisen-Schmidt μεταξύ κατάλληλα υποκατεστημένων 2-υδροξυ-ακετοφαινονών και βενζαλδεϋδών, 10 ήταν της κατηγορίας των ωρονών, οι 7 εκ’ των οποίων συντέθηκαν από χαλκόνες μέσω οξειδωτικής κυκλοποίησης με χρήση Hg(OAc)2 ως καταλύτη (4a-g), ενώ οι 3 συντέθηκαν μέσω αποπροστασίας ωρονών (5a-c). Επιπλέον συντέθηκαν 2 υβριδικές ενώσεις από δημιουργία εστέρων ωρονών και λιποϊκού οξέος (7a-b). Μετά από την σύνθεση των ανωτέρω ακολούθησε η λήψη και αποτίμηση των φασμάτων NMR τους, καθώς και η λήψη και ο πλήρης χαρακτηρισμός φασμάτων NMR δύο διαστάσεων τριών αποπροστατευμένων ωρονών. Επιπροσθέτως, έγιναν in silico μελέτες μοριακής πρόσδεσης για τον προσδιορισμό της ικανότητας πρόσδεσης των μορίων σε διαφορετικές μορφές τυροσινάσης, και συνεπώς και την αναστολή της δρασης της. Ένα δεύτερο σκέλος των in silico μελετών ήταν η αναζήτηση δομικών τροποποιήσεων πάνω στα ήδη υπάρχοντα μόρια ούτως ώστε να διερευνηθεί ο τρόπος πρόσδεσης των μορίων στο ενεργό κέντρο της τυροσινάσης αλλά και να βελτιωθεί η ισχύς πρόσδεσης των φαρμακευτικών μορίων στο ενεργό κέντρο της τυροσινάσης και συνεπώς η ικανότητα αναστολής της δράσης της. Αξιολογήθηκε επίσης και η in vitro βιολογική δράση των νέων ωρονών με τέσσερεις τρόπους: Κατά πρώτον, μελετήθηκε η αντιοξειδωτική ικανότητα των ωρονών 5a-c, αλλά και μιας φυσικής ωρόνης, της ωρεοσιδίνης, μέσω μέτρησης της ικανότητας δέσμευσης Η2Ο2 με χρήση της μεθόδου της χημειοφωταύγειας της λουμινόλης αλλά και μέσω μέτρησης της ικανότητας δέσμευσης της ελεύθερης ρίζας DPPH. Κατά δεύτερον, αξιολογήθηκε το ηλεκτροχημικό προφίλ των ίδιων ωρονών μέσω κυκλικής βολταμμετρίας και έγινε συσχέτιση του δυναμικού ανόδου με την αντιοξειδωτική δράση. Από τα αποτελέσματα που προέκυψαν αλλά και μέσω σύγκρισης αυτών με το γνωστό δυναμικό ανόδου του L(+) ασκορβικού οξέος, το οποίο είναι γνωστό αντιοξειδωτικό, προκύπτει πως οι ωρόνες 5a-c έχουν σημαντική αντιοξειδωτική δράση. Κατά τρίτον, αξιολογήθηκε η αντικαρκινική δράση των 4b-g, 5a-c και της ωρεοσιδίνης όσον αφορά την αναστολή της ανάπτυξης των καρκινικών κυττάρων της σειράς HeLa. Από τα αποτελέσματα προκύπτει πως η ωρεοσιδίνη και οι 5a-c μπορούν να δράσουν ως ικανοί αναστολείς της ανάπτυξης των κυττάρων HeLa και συνεπώς θα ακολουθήσει πιο ενδελεχής μελέτη της αντικαρκινικής δράσης τους. Εν τέλει, μελετήθηκε η ικανότητα των ωρονών 4f-g και 5a-c να αναστέλλουν την δράση της τυροσινάσης από το μανιτάρι Agaricus Bisporus. Παρατηρήθηκε πως οι 5b-c ενισχύουν την δράση της τυροσινάσης, ενώ οι 4f-g και 5a μπορούν να δράσουν ως αναστολείς, και να ταξινομηθούν κατά φθίνουσα ανασταλτική ισχύ ως 4g, 5a και 4f.

This diploma thesis was conducted in the academic year 2012-2013 at the Laboratory of Organic Chemistry, School of Chemical Engineering at NTUA and deals with the design, synthesis and characterization of new aurones with combined biological activity. Initially, preliminary in silico molecular docking studies were conducted in order to find structural motifs in organic compounds that can lead to the inhibition of the enzyme tyrosinase. Taking the results of these studies into consideration, it was concluded that the most appropriate compound classes to be synthesized were chalcones and aurones, which also exhibit significant antioxidant activity. A total of 19 new compounds were synthesided. Of these, 7 were chalcones (3a-g), which were synthesized by Claisen-Schmidt condensation reactions between appropriately substituted 2-hydroxy benzaldehydes and acetophenones, 10 were aurones, 7 of which were synthesized by oxidative cyclization of chalcones using Hg(OAc)2 as catalyst (4a-g), while 3 were synthesized by aurone deprotection (5a-c). Moreover, 2 hybrid compounds were synthesized through the creation of auronelipoic adid esters (7a-b). The synthesis of the above was followed by characterizing their NMR spectra, as well as completely characterizing the two-dimensional NMR spectra of the three deprotected aurones. Additionally, in silico molecular docking studies were conducted to determine the binding ability of molecules in different tyrosinase forms, thus inhibiting its action. A second part of the in silico studies was to search for structural modifications on the existing molecules in order to investigate binding modes of molecules in the tyrosinase active site and to improve the binding strength of pharmaceutical molecules in the active site of the tyrosinase and thus their ability to inhibit it. Moreover, the in vitro biological activity of new aurones was evaluated in four ways: Firstly, the antioxidant capacity of aurones 5a-c was studied, as well as that of a natural aurone, aureusidin, by measuring H2O2 binding ability via the luminol chemiluminescence method and by measuring the capacity to scavenge the free radical DPPH. Secondly, the electrochemical profiles of the same aurones were evaluated through cyclic voltammetry and the anode potentials were correlated with antioxidant activity. From the results obtained and by comparing these with the known anode potential of L(+) ascorbic acid, which is a known antioxidant, it is shown that aurones 5a-c have significant antioxidant activity. Thirdly, the anticancer properties of 4b-g, 5a-c and auresidin was evaluated concerning the inhibition of the growth of HeLa cancer cells. The results show that the auresidin and 5a-c may act as potent inhibitors of the growth of HeLa cells, and therefore more thorough study of their anticancer activity will follow. Finally, we studied the ability of aurones 4f-g and 5a-c to inhibit the activity of tyrosinase taken from mushroom Agaricus Bisporus. It was observed that 5b-c enhance the effect of tyrosinase, while 4f-g and 5a can act as inhibitors, and can be ordered with descending inhibitory potency as: 4g, 5a and 4f.