Χαρακτηρισμός Μαγνητικών Νανοσωματιδίων γ-Fe2O3 για Εντοπισμένη Καρκινική Θεραπεία

Abstract

Ο καρκίνος χαρακτηρίζεται ως μία από τις ασθένειες με τα μεγαλύτερα ποσοστα θνησιμότητας παγκοσμίως, με τις δυνατότητες αντιμετώπισής του να βρίσκονται ακόμα σε πρώιμο στάδιο. Οι κύριες μορφές θεραπείας που χρησιμοποιούνται είναι η χημειοθεραπεία, η ακτινοθεραπεία και η χειρουργική επέμβαση. Η ανάπτυξη του τομέα της νανοτεχνολογίας τα τελευταία χρόνια, σε συνδυασμό με τις μοναδικές ιδιότητες των νανοσωματιδίων, έδωσε τη δυνατότητα έρευνας και ανάπτυξης εναλλακτικών μεθόδων καταπολέμησης του καρκίνου. Το μικρό τους μέγεθος στην κλίμακα του νανομέτρου, το μεγάλο εμβαδόν της επιφανείας τους, η δυνατότητα διαχείρησης τους από απόσταση και οι σχεδόν μηδενικές παρενέργειες καθιστούν τα μαγνητικά νανοσωματίδια πολύ αποτελεσματικά για την εφαρμογή τους στην βιοϊατρική, στη διάγνωση και θεραπεία του καρκίνου ειδικότερα. Με κατάλληλες τροποποιήσεις της επιφάνειας των νανοσωματιδίων, μπορούν να προσδεθούν σε αυτά είτε παράγοντες για τη διάγνωση καρκινικών όγκων, είτε φάρμακα, τα οποία εγχύονται κατευθείαν πάνω στον όγκο. Τα σωματίδια χορηγούνται με ένεση στον οργανισμό, κινούνται μέσω του κυκλοφοριακού συτήματος και κατευθύνονται με εξωτερικό μαγνητικό πεδίο στο όργανο-στόχο (στοχευμένη θεραπεία). Επίσης, μέσω εξωτερικού μαγνητικού πεδίου, μπορεί να προκληθεί αύξηση της θερμοκρασίας των νανοσωματιδίων (στους 45οC περίπου), με αποτέλεσμα την καταστροφή των καρκινικών κυττάρων χωρίς να επηρεάζονται τα υγιή. Οι πρόσφατες προσεγγίσεις χρησιμοποιούν νανοσωματίδια για τη μεταφορά των φαρμάκων με υψηλή ακρίβεια στο στόχο, στο χρόνο και στην ποσότητα που απαιτείται, μειώνοντας τις παρενέργειες και το κόστος των θεραπειών. Υπερπαραμαγνητικά νανοσωματίδια, με κατάλληλη επιφανειακή χημεία, έχουν χρησιμοποιηθεί πειραματικά σε πολυάριθμες και πολλά υποσχόμενες in vivo εφαρμογές, όπως αναγέννηση (αναδόμηση/ανάπλαση) ιστών, υπερθερμία, απεικόνιση μαγνητικού συντονισμού (MRI), μεταφορά φαρμάκων και διάγνωση καρκίνου και άλλων ασθενειών (διαβήτη, καρδιακές παθήσεις, Alzheimer και Parkinson, νευρολογικές παθήσεις). Στόχος της διπλωματικής εργασίας είναι η μελέτη και ανάλυση των διαφορετικών τεχνικών χαρακτηρισμού που χρησιμοποιούνται για την παρακολούθηση της ανάπτυξης βιοσυμβατών μαγνητικών νανοσωματιδίων οξειδίων του σιδήρου γ-Fe2O3, ικανά να περικλείουν και να μεταφέρουν φαρμακευτικές ουσίες, μη διαλυτές σε υδατικά μέσα (π.χ., βιολογικά υγρά), με εφαρμογή εξωτερικού μαγνητικού πεδίου. Τα σωματίδια γ- Fe2O3 περιέχουν ένα μαγνητικό πυρήνα, επικαλυμμένο με οργανόφιλο στρώμα, το οποίο συγκρατεί τη φαρμακευτική ουσία, και εξωτερικά περιβάλλονται από ένα υδρόφιλο στρώμα που προσδίδει διαλυτότητα στο νερό, βιοσυμβατότητα, προστασία των σωματιδίων από τα φαγοκύτταρα του ενδοθηλιακού συστήματος και αυξάνει το χρόνο ημιζωής στο κυκλοφορικό σύστημα. Πιο συγκεκριμένα, οργανόφιλα μαγνητικά σωματίδια παρέχουν τη δυνατότητα στα υλικά να εγκλωβίσουν φαρμακευτικές ουσίες που παρουσιάζουν προβλήματα διαλυτότητας στο Η2Ο. Υδρόφιλα μαγνητικά σωματίδια μπορούν να εγκλωβίσουν φαρμακευτικές ουσίες, παράγοντες υπερθερμίας (επικάλυψη με χρυσό Au ή άλλα στοιχεία) και να συζευχθούν με γονίδια ή πεπτίδια για τον εντοπισμό καρκινικών όγκων στα κύτταρα και στους ιστούς. Τέλος, αμφίφιλα μαγνητικά σωματίδια, παραμένουν διαλυτά και διασπειρόμενα σε οργανικό διαλύτη και ταυτόχρονα διαλυτά σε Η2Ο και δύνανται να εγκλωβίσουν φάρμακα στην οργανόφιλη φάση τους και να μεταφερθούν, μαζί με το περιεχόμενο φάρμακο, στην υδατική φάση. Στη διάγνωση και θεραπεία του καρκίνου, απαιτούνται νανοσωματίδια με υψηλές τιμές μαγνήτισης και μέγεθος <100 nm, με ομοιόμορφη κατανομή, και να παρουσιάζουν κατάλληλες φυσικές και χημικές ιδιότητες. Επιπλέον, η ειδική επιφανειακή επικάλυψη των μαγνητικών σωματιδίων, όχι μόνο πρέπει να είναι μη τοξική και βιοσυμβατή, αλλά επιπλέον να επιτρέπει τη στοχευόμενη μεταφορά των σωματιδίων. Στην παρούσα διπλωματική εργασία, πραγματοποιήθηκε η ανάλυση των δεδομένων χαρακτηρισμού που συλλέγονται από πλήθος τεχνικών χαρακτηρισμού, με στόχο να ελεγχθεί κατά πόσο η προσθήκη επιφανειοδραστικών ενώσεων διαφορετικής φύσης και σε διαφορετικές αναλογίες επηρεάζει τη δομή και τις ιδιότητες των μαγνητικών νανοσωματιδίων. Αναλύθηκαν τα δεδομένα της δομής, μορφολογίας, επιφανειακής χημείας και των μαγνητικών ιδιοτήτων οργανόφιλων, υδρόφιλων και αμφίφιλων νανοσωματιδίων που παρασκευάστηκαν μέσω χημικής σύνθεσης σε οργανικό διαλύτη. Επίσης, ερμηνεύτηκαν τα αποτελέσματα μετρήσεων μαγνητικής υπερθερμίας, υδροδυναμικού μεγέθους και ζ-δυναμικού, ώστε να προσδιοριστεί ο ρυθμός αύξησης της θερμοκρασίας και η τάση συσσωμάτωσης που εμφανίζουν τα νανοσωματίδια στη μεταβολή των συνθηκών θερμοκρασίας και pH (αύξηση μεγέθους-φραγμός αρτηριών). Τέλος, χαρακτηρίστηκαν τα φάσματα που ελήφθησαν για τη μελέτη της επιφανειακής χημείας, μορφοποιημένων υδρόφιλων νανοσωματιδίων που παρασκευάστηκαν για να εγκλωβίσουν και μεταφέρουν στον κατάλληλο στόχο φάρμακα, όπως η δοξορουβυκίνη (dxorubicin, DOX). Η διαδικασία που ακολουθήθηκε για τη μορφοποίηση, περιελάμβανε αφενός τη σύνδεση τροποποιημένης λυσίνης στην επιφάνεια των σωματιδίων, και τροποποιημένης mPEG, συνδεδεμένης με μαλεαμίδιο, στις δραστικές ομάδες των μαγνητικών νανοσωματιδίων. Στη συνέχεια, συνδέεται φολικό οξύ στην επιφάνεια των νανοσωματιδίων, ώστε να επιτευχθεί η στοχευμένη θεραπεία. Πραγματοποιήθηκε ερμηνεία και ανάλυση δεδομένων από πληθώρα τεχνικών χαρακτηρισμού, όπως XRD, TEM, SEM, NMR, FT-IR, XPS, DLS και VSM, έτσι ώστε να λάβουμε μια όσο το δυνατόν καλύτερη γνώση των ιδιοτήτων και χαρακτηριστικών του κάθε υλικού. Περαιτέρω έρευνες περιλαμβάνουν εναλλακτικές και με μεγαλύτερη ανάλυση τεχνικές χαρακτηρισμού των νανοσωματιδίων (κυρίως του μεγέθους τους), τον εγκλωβισμό αντικαρκινικών φαρμάκων σε αυτά και μελέτη της συμπεριφοράς τους και της αποδέσμευσης του περιεχομένου τους in vivo.

Cancer is considered among the diseases with the highest mortality rates worldwide, while the potentials of its confrontation being still in a premature stage. The most common types of cure applied include chemotherapy, radiotherapy and surgery. However, developments in the field of nanotechnology in the last few years, combined with the unique properties of nanoparticles, have led to the research of alternative ways for defeating cancer. The small size of the particles in the scale of nanometers, the large surface area, the ability of controlling them by distance and their almost zero side effects render magnetic nanoparticles very efficient for their application in biomedicine and in the diagnosis and treatment of cancer in particular. With appropriate modifications of the surface of the nanoparticles, it is possible to attach onto them either contrast agents for the diagnosis of tumors, or drugs for therapy, which are injected and driven directly to the tumor. The nanoparticles are injected into the human body, move through the circulatory system and directed by an external magnetic field to the target organ (targeted therapy). Furthermore, the external magnetic field, may cause increase in the temperature of the nanoparticles (at about 45°C), resulting in the destruction of cancer cells without affecting the healthy ones. Recent approaches involve using nanoparticles to deliver the drug with high accuracy in order, in time and in the quantity required, reducing the side effects and the cost of treatment. Superparamagnetic nanoparticles, with appropriate surface chemistry, are used in numerous experimental and promising in vivo applications, such as tissue regeneration, hyperthermia, magnetic resonance imaging (MRI), drug delivery and diagnosis, such as cancer and other diseases (diabetes, heart disease, Alzheimer and Parkinson disease, and in general, neurological disorders).

The aim of this thesis is the characterization and analysis of techniques used to monitor the synthesis and modification of biocompatible magnetic nanoparticles of iron oxide γ-Fe2O3, able to enclose and deliver drugs, insoluble in aqueous media (e.g., biological fluids) by applying an external magnetic field. The γ- Fe2O3 particles contain a magnetic core, coated with an organophilic layer, which retains the drug and externally it is surrounded by a hydrophilic layer, which imparts water solubility, biocompatibility, protection of the particles from the phagocytes of the endothelial system and increases the half-life time in the circulatory system. More specific, organophilic magnetic particles enable several materials to entrap drugs that present solubility problems in H2O. Hydrophilic magnetic particles can enclose drugs, factors used in hyperthermia (Au coated with gold or other elements) and coupled with genes or peptides for detecting tumor cells and tissues. Amphiphilic magnetic nanoparticles remain soluble and dispersible in organic solvents and H2O. The amphiphilic particles may entrap drugs in organophilic phase and later on transferred to the aqueous phase. The diagnosis and treatment of cancer require nanoparticles with high magnetization and size <100 nm, with a uniform distribution, so as to exhibit suitable physical and chemical properties. Furthermore, the specific surface coating of the magnetic particles not only should be non-toxic and biocompatible, but additionally has to allow the targeted transfer of particles.

In this diploma thesis, interpretation and analysis were conducted, of data obtained by characterization techniques, in order to check in which way the modification of nanoparticles by surfactants of different nature and proportions, affects their structure and properties. Data of the structure, morphology, surface chemistry and magnetic properties were analyzed, for organophilic, hydrophilic and amphiphilic nanoparticles, prepared by chemical synthesis in organic solvent. Furthermore, the results of magnetic hyperthermia, hydrodynamic size and z-potential measurements were defined, in order to determine the rate of temperature increase and the tendency to aggregate exhibiting nanoparticles on changing temperature and pH (increasing size may cause block of arteries). Finally, characterization of spectrums was held, extracted by modified hydrophilic nanoparticles, in a way to be suitable for particular drug entrapment and delivery (doxorubicin-DOX). The process of functionalization included the connection of a modified lysine to the particle surface and secondly, the bonding of modified mPEG, coupled with maleamide. Then, folic acid was ligated to the nanoparticles, in order to achieve targeted treatment. Data for interpretation in this study were provided by plenty of characterization techniques, such as XRD, TEM, SEM, NMR, FT-IR, XPS, DLS and VSM, in order to reassure the best possible knowledge of the properties and characteristics of each material. Further investigations include alternative and with higher resolution characterization techniques for the nanoparticles (mainly about the size), entrapping anticancer drugs on the nanoparticles and study the in vivo behavior and release of their content.