Μηχανική της ετερόλογης έκφρασης και χαρακτηρισμός μιας κουτινάσης του μύκητα Fusarium oxysporum

Abstract

Σκοπός της παρούσας διπλωματικής εργασίας ήταν η ετερόλογη έκφραση μιας κουτινάσης (FoCut16606) του μεσόφιλου μύκητα Fusarium oxysporum σε τρεις διαφορετικούς ξενιστές, με στόχο τη βελτίωση της σταθερότητας και αποδοτικότητας του ανασυνδυασμένου βιοκαταλύτη. Αρχικά, η FoCut16606 εκφράσθηκε στο βακτήριο Escherichia coli BL21, το οποίο είχε μετασχηματισθεί με τον πλασμιδιακό φορέα pET22b(+) που έφερε το αντίστοιχο γονίδιο (foxg_16606.3). Η ανασυνδυασμένη πρωτεΐνη παρουσίασε πολύ μικρή θερμοσταθερότητα ακόμα και σε χαμηλές θερμοκρασίες επώασης. Με στόχο τη βελτίωση της σταθερότητας, η αναδίπλωση του ενζύμου πραγματοποιήθηκε στον περιπλασμικό χώρο των E. coli BL21 χρησιμοποιώντας τη σηματοδοτική αλληλουχία pelB. Η περιπλασμική έκφραση δίνει τη δυνατότητα δημιουργίας δισουλφιδικών δεσμών, που κρίνονται απαραίτητοι για την αύξηση της σταθερότητας. Παρόλο που η ανασυνδυασμένη κουτινάση παρουσίασε βελτιωμένες ιδιότητες, δεν θεωρήθηκε ικανοποιητική για εφαρμογές στη Βιομηχανία. Για την δημιουργία δισουλφιδικών δεσμών στο κυτταροπλασματικό περιβάλλον, χρησιμοποιήθηκε ως ξενιστής το βακτηριακό στέλεχος E. coli Origami2. Παρότι δοκιμάστηκε και η περιπλασμική έκφραση του ενζύμου, χρησιμοποιώντας τη σηματοδοτική αλληλουχία pelB, το ένζυμο που παρήχθη ενδοκυτταρικά βρέθηκε σταθερότερο. Δεν υφίστατο απώλειες ενεργότητας στους 20 οC, ενώ διατήρησε λιγότερο από το 20% της αρχικής του ενεργότητας ύστερα από 4 h στους 40 οC. Ο εντοπισμός ενεργότητας κουτινάσης σε όλα τα προαναφερθέντα συστήματα έκφρασης μελετήθηκε τόσο στον εξωκυτταρικό χώρο, όσο και στον εσωκυτταρικό ως διαλυτή πρωτεΐνη ή έγκλειστα σωμάτια (inclusion bodies), σε δύο διαφορετικές θερμοκρασίες επαγωγής (37 και 16 οC). Στις παραγωγές που πραγματοποιήθηκαν στους 37 οC η πλειοψηφία της ενεργότητας κουτινάσης εντοπίστηκε στα inclusion bodies, ενώ στους 16 οC στο κυτταρόπλασμα. Ύστερα από απομόνωση, τα ανασυνδυασμένα ένζυμα ( ̴23 kDa) χρησιμοποιήθηκαν για κινητικές μελέτες σε τρεις εστέρες της παρα-νιτροφαινόλης με διαφορετικό μήκος αλυσίδας – C2, C4 και C12. Με κριτήριο την κινητική σταθερά Km, τα ανασυνδυασμένα ένζυμα έδειξαν μεγαλύτερη συγγένεια με τον εστέρα με τα 4 άτομα άνθρακα. Η θερμοσταθερότητα της FoCut16606 αυξήθηκε σημαντικά, όταν αυτή εκφράσθηκε σε ευκαρυωτικό ξενιστή, τη μεθυλότροφη ζύμη Pichia pastoris η οποία δίνει τη δυνατότητα μετα-μεταφραστικών τροποποιήσεων, όπως σχηματισμό δισουλφιδικών δεσμών και γλυκοζυλίωση. Τα κύτταρα της P. pastoris X33 μετασχηματίσθηκαν με τον πλασμιδιακό φορέα pPICZαC, ο οποίος έφερε το γονίδιο foxg_16606.3 ρυθμιζόμενο από τον υποκινητή της αλκοολικής οξειδάσης (AOX1), καθώς και την αλληλουχία α-factor (προέλευση από τη ζύμη Saccharomyces cerevisiae) για την έκκριση της ανασυνδυασμένης πρωτεΐνης εξωκυτταρικά. Το ανασυνδυασμένο αυτό ένζυμο παρέμενε σταθερό στους 30 οC, ενώ έχανε το 40% τις αρχικής του ενεργότητας στους 55 οC και το 80% στους 70 οC, ύστερα από 4 h επώαση. Στη συνέχεια πραγματοποιήθηκε έρευνα της επίπτωσης διαφόρων οργανικών διαλυτών στην ενζυμική ενεργότητα των ανασυνδυασμένων πρωτεϊνών. Όλες έδειξαν αντοχή στην επώαση στους διαλύτες και περισσότερο το προϊόν της περιπλασμικής έκφρασης των BL21. Αυτή η ιδιότητα καθιστά την FoCut16606 κατάλληλη για εφαρμογές σε μη συμβατικά συστήματα.

The purpose of the present diploma thesis was the heterologous expression of a cutinase (FoCut16606) from the mesophilic fungus Fusarium oxysporum in three different hosts, in order to improve the stability and efficiency of the recombinant biocatalyst. Initially, FoCut16606 was expressed in Escherichia coli BL21, which was transformed with the plasmid vector pET22b(+) carrying the corresponding gene (foxg_16606.3). The recombinant protein showed very little thermal stability even at low incubation temperatures. To overcome temperature sensitivity, the expression took place in the perisplasmic space of E. coli BL21 using the signal peptide pelB. Periplasmic expression allows the formation of disulfide bonds which are deemed necessary to increase stability. Although the recombinant cutinase displayed improved properties, it was not considered satisfactory for industrial applications. For the creation of disulfide bonds in the cytosolic environment, bacterial strain E. coli Origami2 was subsequently used as the host. Although periplasmic expression was also tested, using pelB signal peptide, the enzyme produced intracellularly was more stable. It suffered no activity losses at 20 οC and retained less than 20% of its initial activity after a 4-hour incubation at 40 οC. The occurrence of cutinase activity in all the aforementioned expression systems was examined both in the extracellular and intracellular space, as soluble protein or inclusion bodies, in two different temperatures (37 και 16 οC). Most of the cutinase activity was detected in inclsion bodies at 37 οC expression, while at 16 οC it was mainly found in the cytosol. After the purification of the recombinant enzymes ( ̴23 kDa) kinetic studies were performed using three synthetic esters with different carbon chain length – C2, C4 και C12. Judging by the values of Km kinetic constant, the enzymes showed higher affinity with the C4 ester. The thermostability of FoCut16606 increased significantly when it was expressed in an eukaryotic host, the methylotrophic yeast Pichia pastoris. The latter is capable of performing post-translational modifications such as disulfide bond formation and glycosylation. P. pastoris X33 cells were transformed by the vector pPICZαC carrying foxg_16606.3 gene, regulated by the alcohol oxidase promoter (AOX1) and the a-factor sequence (from the yeast Saccharomyces cerevisiae) for extracellular secretion of the recombinant protein. This enzyme remained stable during incubation at 30 οC and lost 40% kai 80% of its initial activity after a 4-hour incubation in 55 οC and 70 οC respectively. Finally, the impact of various organic solvents on the enzymatic activity of recombinant proteins was investigated. All enzymes showed high tolerance in the solvents used, but the product of the periplasmic expression in BL21 seemed to be the most tolerant. This property of FoCut16606 makes it suitable for application in non-conventional media.