Μελέτη της επίδρασης εκχυλισμάτων από φυτά της ελληνικής χλωρίδας στην αγγειογένεση

Abstract

Η φύση είναι μια ανεξάντλητη πηγή χημικών μορίων με σημαντικές βιολογικές ιδιότητες και εντυπωσιακά σε ποικιλία και πρωτοτυπία δομικά χαρακτηριστικά που είναι αδύνατο να προσεγγιστούν από οποιοδήποτε συνθετικό εργαστήριο. Το γεγονός αυτό, καθιστά τα φυσικά προϊόντα εξαιρετικά ενδιαφέροντα από ερευνητικής σκοπιάς για την ανάπτυξη νέων φαρμακευτικών προϊόντων. Η παρούσα διπλωματική εργασία αποτελεί ένα πολύ μικρό βήμα προς την κατεύθυνση αυτή. Αντικείμενο της αποτέλεσε ο συστηματικός έλεγχος 111 επιμέρους κλασμάτων δραστικών εκχυλισμάτων, τα οποία έχουν απομονωθεί από φυτά της ελληνικής χλωρίδας, σχετικά με την ικανότητά τους να αναστέλλουν ή να επάγουν την αγγειογένεση. Η βιολογική αυτή διαδικασία ορίζεται ως ο σχηματισμός νέων αγγείων από ήδη υπάρχοντα, και λόγω της εμπλοκής σε πολλά νοσήματα και ειδικά στον καρκίνο, υπάρχει έντονο ενδιαφέρον για την ανάπτυξη ενώσεων που μπορούν να την επηρεάζουν. Τα εξεταζόμενα κλάσματα προήλθαν από εκχυλίσματα φυτών που ευδοκιμούν στην Ελλάδα (Asphodeline lutea, Glycyrrhiza glabra, Nepeta orphanidea var. Parnidea, Onobrychis ebenoides, Salvia argentea, Amelanchier parviflora subsp. Chelmea, Daphne oleoides , Inula pseudolimonella, Bupleurum fruticosum, Laserpitium pseudomeum), είναι άγνωστα για το ευρύ κοινό και το μεγαλύτερο μέρος τους εξετάζεται για πρώτη φορά. Στην εργασία αυτή, παρουσιάζονται τα αποτελέσματα αυτού του ελέγχου σε ένα πειραματικό in vitro μοντέλο προσομοίωσης της ανάπτυξης της δομικής μονάδας των αγγειακών τοιχωμάτων, τα ενδοθηλιακά κύτταρα. Στην εν λόγω μελέτη χρησιμοποιήθηκε η κυτταρική σειρά ενδοθηλιακών κυττάρων EA.hy926 τα οποία παρουσιάζουν λειτουργικά χαρακτηριστικά διαφοροποιημένων ενδοθηλιακών κυττάρων και θεωρούνται κατάλληλα πειραματικά μοντέλα στον προσδιορισμό του κυτταρικού πολλαπλασιασμού. Οι υπό μελέτη ουσίες προστέθηκαν σε καλλιέργειες EA.hy926 κατά την εκθετική φάση ανάπτυξής τους και στη συνέχεια, ελέγχθηκε η ικανότητά τους να μεταβάλλουν τον ρυθμό πολλαπλασιασμού ή/και τη βιωσιμότητα των κυττάρων, χρησιμοποιώντας τη μέθοδο ΜΤΤ [3-(4,5-Dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyltetrazolium bromide]. Τα κλάσματα που παρουσίασαν δραστικότητα, κατατάχτηκαν βάσει της ικανότητάς τους να επηρεάζουν τον κυτταρικό πολλαπλασιασμό σε τέσσερεις κατηγορίες: 1) ουσίες με ανασταλτική δράση, 2) ουσίες με κυτταροτοξική δράση 3) ουσίες με επαγωγική δράση και 4) ουσίες με μη σημαντική επίδραση. Βρέθηκε ότι πάνω από το 50% των κλαμάτων παρουσίασαν ανασταλτική δράση στον EA.hy926 κυτταρικό πολλαπλασιασμό και ενδεχομένως να έχουν αντι-αγγειογενετική δράση. Επίσης, αξιοσημείωτο είναι ότι ένα μεγάλο ποσοστό των κλασμάτων αυτής της κατηγορίας προκαλούν μείωση του κυτταρικού πολλαπλασιασμού κατά το ήμισυ σε σχέση με τον αρνητικό μάρτυρα, αποτέλεσμα το οποίο, είναι πολύ ενθαρρυντικό για μετέπειτα μελέτες προσδιορισμού μεμονωμένων ενώσεων με αντι-αγγειογενετική δράση. Επιπλέον, βρέθηκε ότι περίπου το 10% των εξεταζόμενων κλασμάτων είχαν επαγωγική δράση στο κυτταρικό πολλαπλασιασμό επομένως πιθανά να προάγουν την αγγειογένεση. Τέλος, τα υπόλοιπα κλάσματα είτε εμφάνισαν υψηλή κυτταροτοξική δράση, είτε δεν είχαν κάποια σημαντική επίδραση στην αγγειογένεση και συνεπώς δεν παρουσιάζουν περαιτέρω ερευνητικό ενδιαφέρον. Στο δεύτερο σκέλος της πειραματικής διαδικασίας, διερευνήθηκε η επίδραση καθαρών ενώσεων (Κερκετίνη, Γαλλικό άλας της επιγαλλοκατε¬χίνης (EGCG), Εριοδικτυόλη, Φισετίνη, Κουρκουμίνη, Περιλλύλ αλκοόλη (POH), Ναρινγενίνη) προερχόμενων από φυσικά προϊόντα, στην αγγειογένεση. Η διαδικασία αυτή, επιτεύχθηκε προσδιορίζοντας την συγκέντρωση του εκκρινόμενου αυξητικού παράγοντα του ενδοθηλίου (VEGF) σε υπερκείμενα καρκινικών κυττάρων της σειράς ανθρώπινου ηπατοκαρκινώματος (Hep3B) μέσω της μη ανταγωνιστικής μεθόδου ELISA. Το VEGF παίζει πρωταγωνιστικό ρόλο στην διαδικασία της αγγειογένεσης και θεωρείται ένας κρίσιμος ρυθμιστής της αγγειακής ανάπτυξης, επομένως μια ενδεχόμενη μεταβολή στα επίπεδα έκκρισής του υποδηλώνει μια επίδραση στην αγγειογένεση. Βρέθηκε ότι μόνο οι φυσικές ενώσεις EGCG, Φισετίνη και Ναρινγκενίνη μείωσαν σημαντικά τα επίπεδα έκκρισης του VEGF στο υπερκείμενο κυττάρων Hep3B, συνεπώς οι ενώσεις αυτές ενδέχεται να αναστέλλουν και την επαγόμενη από τα καρκινικά κύτταρα Hep3B αγγειογένεση.

Nature is an inexhaustible source of chemical molecules with important biological properties and an impressive variety and originality of structural characteristics, that cannot be accessed (approached) by any synthetic laboratory. This fact, makes natural products extremely interesting candidates for the development of new pharmaceutical products. The aim of the present diploma thesis was the systematic screening of a series of 111 partial fractions of bioactive extracts, which have been isolated from plants of Greek flora, for their ability to inhibit or induce the process of angiogenesis. This complex biological process, defined as the generation of new blood vessels from pre-existing ones is involved in many diseases, including cancer. Therefore, there is an intense interest in developing compounds that can be used as angiogenesis modulators. Test fractions were derived from extracts of plants that flourish in Greece (Asphodeline lutea, Glycyrrhiza glabra, Nepeta orphanidea var. Parnidea, Onobrychis ebenoides, Salvia argentea, Amelanchier parviflora subsp. Chelmea, Daphne oleoides, Inula pseudolimonella, Bupleurum fruticosum, Laserpitium pseudomeum). Most of these plants are unknown to the general public and their extracts are currently tested for the first time. The screening was performed using an experimental in vitro model simulating a very basic pro-angiogenic function, the proliferation of endothelial cells which are the structural units of vessel walls. We used the endothelial cell line EA.hy 926, which has functional characteristics of differentiated endothelial cells and consequently is considered as a suitable experimental model for the determination of endothelial cell proliferation. The examined substanceswere added to EA.hy926 cells grown at exponential phase and then their ability to alter the rate of cell proliferation and/or cell viability was determined using an MTT [3-(4,5-Dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyltetrazolium bromide] assay. The fractions that showed effectiveness were classified based on their ability to modulate cell proliferation, into four categories: 1) fractions with inhibitory activity 2) fractions with cytotoxic activity 3) fractions with inducing activity 4) fractions with a non-significant activity. It was found that over 50% of fractions exhibited an inhibitory effect on EA.hy926 cell proliferation and thus may have anti-angiogenic action. A remarkable finding is that a large percentage of fractions belonging to this category, caused a 50% reduction in cell proliferation compared to vehicle control. This result is very encouraging for subsequent studies aiming to identify individual components with anti-angiogenic action. Moreover, it was found that approximately 10% of examined fractions had an inducing effect on cell proliferation, so they probably could stimulate angiogenesis. Finally, the remaining fractions were either ineffective or showed high cytotoxicity, so they do not merit research interest. In the second part of the present thesis we investigated the effect of various isolated pure plant compounds, namely quercetin, (-)-epigallocatechin gallate, eriodictyol, fisetin, curcuminperillyl alcohol and naringenin on cancer-related angiogenesis. This was accomplished by determining the ability of test agents to modify the levels of vascular endothelial growth factor (VEGF) that was secreted by treated human hepatocarcinomas Hep3B cells using a non-competitive ELISA method. Since VEGF plays a leading role in the process of angiogenesis and is a critical regulator of vascular development, a potential change of its expression by HEP3B cells could significantly affect angiogenesis. Among test compounds, it was found that (-)-epigallocatechin gallate, fisetin and naringenin, significantly reduced the levels of VEGF in the supernatant of treated Hep3B cells, thus these compounds may be potential inhibitors of Hep3B-induced angiogenesis.