Παραγωγή της ενδο-1,4-β-γλουκανάσης StEG5a του Myceliophthora Thermophila από τον ζυμομύκητα Pichia Pastoris

Abstract

Η παρούσα εργασία έγινε στα πλαίσια προσπάθειας της δημιουργίας ενός συνδυασμού ενζύμων που βιοαποικοδομούν την κυτταρίνη και βελτιστοποίησης των αναλογιών των ενζύμων αυτών με σκοπό την αποδοτικότερη υδρόλυσή της. Η Ρ. pastoris είναι ευκολότερα διαχειρίσιμη γενετικά και στη διαδικασία της καλλιέργειας, από κύτταρα θηλαστικών και μπορεί να αναπτύσσεται σε υψηλές κυτταρικές πυκνότητες. Εξίσου σημαντικά, η P. pastoris είναι επίσης ευκαρυωτική, και έτσι παρέχει τη δυνατότητα για την παραγωγή διαλυτών, σωστά αναδιπλωμένων ανασυνδυασμένων πρωτεϊνών που έχουν υποστεί όλες τις μετα-μεταφραστικές τροποποιήσεις που απαιτούνται για τη λειτουργικότητά τους. Για τους παραπάνω λόγους, στην παρούσα διπλωματική εργασία πραγματοποιήθηκε βελτιστοποίηση της παραγωγής της ενδο-1,4-β-γλουκανάσης StEG5a του μύκητα Myceliophthora thermophila από τον ζυμομύκητα P.pastoris. Αρχικά, πραγματοποιήθηκε παραγωγή και καθαρισμός των ανασυνδυασμένων πρωτεϊνών ενδο-1,4-β-γλουκανάσης StEG5α και εξω-1,4-β-γλουκανάσης (κελλοβιοϋδρολάσης) StCBH6α από μετασχηματισμένα κύτταρα P.pastoris. Στη συνέχεια, αναπτύχθηκαν καλλιέργειες μικρής και μεγάλης κλίμακας μετασχηματισμένων κυττάρων P.pastoris και μελετήθηκε η επίδραση του pH, του ποσοστού (% v/v) μεθανόλης, της ταχύτητας ανάδευσης (rpm), αλλά και του τύπου φιάλης (Flat-Base και Baffled-Base Erlenmeyer Flasks) στην ανάπτυξη των κυττάρων της ζύμης, στην ενεργότητα της ενδο-1,4-β-γλουκανάσης StEG5α και την πρωτεϊνική συγκέντρωση του υπερκειμένου της καλλιέργειας. Τα εξαγόμενα αποτελέσματα συζητήθηκαν και συγκρίθηκαν με αντίστοιχα που προέκυψαν από δημοσιευμένες έρευνες.

This thesis is part of an effort to create a combination of enzymes which biodegrade cellulose and to optimize the proportion of these enzymes to a more efficient hydrolysis. P. pastoris is easier to genetically manipulate and culture than mammalian cells and can be grown to high cell densities. Equally important, P. pastoris is also a eukaryote, and thereby provides the potential for producing soluble, correctly folded recombinant proteins that have undergone all the post-translational modifications required for functionality. For the above reasons, the aim of this thesis is to optimize the production of endo-1,4-β-glucanase StEG5a from the fungus Myceliophthora thermophila by the P.pastoris yeast. Initially, a production and purification of recombinant proteins of endo-1,4-β-glucanase StEG5a and exo-1,4-β-glucanase (cellobiohydrolase) StCBH6a from transformants P.pastoris took place. Afterwards, cultures of P.pastoris cells were grown in both large and small scale and the effect of pH, methanol percentage (% v / v), stirring speed (rpm), and the type of cylinder (Erlenmeyer and baffled) were examined versus the yeast cell growth rate, the activity of endo-1,4-beta-glucanase StEG5a and the protein concentration of the cell-free supernatant of the culture. The results obtained were discussed and compared with corresponding derived from published studies.