Φασματοσκοπική μελέτη καρκινικών οστών

Abstract

Η μετάσταση του καρκίνου των οστών είναι ένα από τα βασικά προβλήματα θεραπείας των καρκινοπαθών, δεδομένου ότι μειώνει την ποιότητα ζωής και αυξάνει την θνητότητα. Οι φυσικοχημικές μέθοδοι της υπέρυθρης φασματοσκοπίας με μετασχηματισμό Fourier, FT-IR και ανάλυση με ηλεκτρονικό μικροσκόπιο SEM, εφαρμόστηκαν για την μελέτη των μεταβολών στην μοριακή δομή και την μορφολογία των οστών τις οποίες προκαλεί ο μεταστατικός καρκίνος. Η μελέτη περιλαμβάνει δείγματα από το μηριαίο οστό, βραχίονα και κερκίδας, ενηλίκων ασθενών ηλικίας 31 έως 82 ετών, οι οποίοι έπασχαν από μεταστατικό καρκίνο των οστών, όπως διαγνώσθηκε ιστοπαθολογικά με χρώση κατά GoldamTrichrome. Για την ανάλυση SEM, προκειμένου να μη χαθούν χρήσιμες πληροφορίες τα δείγματα δεν επικαλύφθηκαν με χρυσό ή άνθρακα. Ο αριθμός των δειγμάτων είναι περιορισμένος επειδή τα κατάγματα συμβαίνουν κυρίως στα τελευταία στάδια της ασθένειας και οι περισσότεροι ασθενείς δεν φθάνουν ποτέ στο χειρουργείο για αποκατάσταση. Από την συγκριτηκή μελέτη των υπέρυθρων φασμάτων μεταξύ υγιών και καρκινικών οστών διαπιστώθηκαν σημαντικές μεταβολές, οι οποίες αποδόθηκαν στο στάδιο και το είδους του καρκίνου. Γενικά, αποδείχθηκε ότι τα πλέον ευαίσθητα συστατικά των οστών στην επίδραση της ασθένειας είναι οι κολλαγονούχες πρωτεΐνες και τα λιπίδια των μεμβρανών. Από την μεταβολή της δευτεροταγούς δομής των πρωτεϊνών και την παραγωγή αλδεϋδών φαίνεται ότι σε κάποιο από τα στάδια της ασθένειας επιδρούν οι ελεύθερες ρίζες, οι οποίες παράγονται κατά τον μεταβολισμό ή το οξειδωτικό στρες με αποτέλεσμα την υπεροξείδωση των λιπιδίων και φωσφολιπιδίων. Η αύξηση της γλυκοζυλίωσης και οστεοπενίας συνδέθηκαν με βασικά χαρακτηριστικά της ασθένειας και το στάδιο εξέλιξης. Από την μείωση της ταινίας περίπου στα 3500 cm-1 στο υπέρυθρο φάσμα του δείγματος η οποία αντιστοιχεί στις δονήσεις τάσης των ομάδων υδροξυλίου (νΟΗ) του υδροξυαπατίτη, επιβεβαιώνεται η καταστροφή του βιολογικού υδροξυαπατίτη. Η αύξηση των εντάσεων των ταινιών στην περιοχή μεταξύ 3000-2850 cm-1, η οφειλόμενη στις αντισυμμετρικές και συμετρικές δονήσεις τάσης των μεθυλ (vCH3) και μεθυλεν (vCH2) ομάδων αποδίδεται στην καταστροφή των μεμβρανών των καρκινικών κυττάρων. Η ταινία στα 1742 cm-1, η οποία αποδίδεται στην δόνηση τάσης του καρβονυλίου (vCO) εστερικού χαρακτήρα, συνδέεται με την παραγωγή αλδεϋδών κατά την ανάπτυξη της ασθένειας και μπορεί να αποτελέσει δείκτη της πορείας της ασθένειας. Η ταινία αυτή συνδέεται με την υπεροξείδωση των βιολογικών μακρομορίων της μεμβράνης και δείχνει ότι οι ελεύθερες ρίζες συμμετέχουν σε κάποιο στάδιο της ασθένειας. Επιβεβαίωση του φαινομένου αποτελεί το γεγονός ότι η ένταση της ταινίας είναι αυξημένη στους ασθενείς που δέχθηκαν ραδιοθεραπεία. Η μεταβολή των ταινιών των δονήσεων κάμψης των ομάδων Αmide I και Αmide II των πρωτεϊνών στην περιοχή 1650-1500 cm-1, αναδεικνύει ότι η ασθένεια επιδρά στην δευτεροταγή δομή των πρωτεϊνών μεταβάλλοντας την δομή από α-έλικα σε αναδίπλωση β-έλικας και σε προχωρημένο στάδιο σε τυχαία περιέλιξη καταλήγοντας σε σχηματισμό ινιδίων και αμυλοειδών πρωτεϊνών. Ο λόγος των εντάσεων των ταινιών [Amide I1650]:[Amide II1550] αυξάνει σε ασθενείς με μεταστατικό καρκίνο, η δε αύξηση είναι μεγαλύτερη σε όσους έχουν υποβληθεί σε ακτινοθεραπεία. Από τις μεταβολές του φάσματος στην περιοχή 1250-900 cm-1, διαπιστώνεται αφενός μεν η αυξημένη παραγωγή πολυγλυκανών (πολυσακχαρίτες) των καρκινικών οστών, αφετέρου η μείωση της ανόργανης φάσης του υδροξυαπατίτη.Τα υπέρυθρα φάσματα έδειξαν ότι η ανόργανη φάση των καρκινικών οστών δεν περιέχει βιολογικό υδροξυαπατίτη, αλλά αποτελείται από άλατα φωσφορικού ασβεστίου [Ca3(PO4)2, CaHPO4], τα οποία μειώνουν την μηχανική αντοχή των οστών. Η αντικατάσταση των φωσφορικών ομάδων του υδροξυαπατίτη με ανθρακικά ιόντα (CO32-) δείχνει την επιταχυνόμενη γήρανση των οστών. Οι μεταβολλές στο DNA φαίνονται από την εμφάνιση των ταινιών στα 830, 820 και 805 cm-1 που δείχνει ότι στα καρκινικά οστά επικρατεί το Ζ-DNA με την παρουσία της ταινίας, 820 cm-1. Το Β-DNA (830 cm-1) είναι το φυσιολογικό, το Α-DNA (805 cm-1) αντιστοιχεί στο μη φυσιολογικό και το Ζ-DNA (820 cm-1) καρκινικό.

Skeletal cancer metastasis is one of the major problems during cancer treatment because it decreases quality of life and increases mortality. The powerful technique of (FT-IR) spectroscopy and the SEM (Scanning Electron microscopy) analysis were used to investigate cancer related changes to the molecular structure and the morphology of the bones. This study includes samples from adult patients who were suffering from bone cancer metastasis. The samples were not coated with carbon or gold in order to avoid losing useful information and ensure better SEM analysis. The detailed study of infrared spectra of cancerous bones demonstrated that the most sensitive components of the bones, that are affected from the disease are collagenous and non collagenous proteins and the lipids of cell membranes. The change of the secondary structure of the proteins and the formation of aldehydes shows that free radicals are involved in a pathway of the disease. The free radicals which are produced during oxidative stress results to the peroxidation of lipids and phospholipids. The glycosylation and osteopenia were connected with basic features of the disease and its developmental stage. The decrease of the absorption band at about 3500 cm-1, due to the stretching vibration of the hydroxyl group of hydroxyapatite, confirms the destruction of biological hydroxyapatite. The increase of the intensities of the absorption bands which correspond to the stretching vibrations of methyl and methylen groups it is linked with the destruction of cell membranes. The characteristic band in the spectra at 1742 cm-1 which is assigned to stretching vibration of carbonyl-ester or aldehydes, is a “marker band” of the presence and progression of the disease. This band is connected with peroxidation of the biological macromolecules of membrane because of the oxidative stress and it increases in the patients who received radiotherapy. This band changes and shifts assigned to bending vibrations of Amide I and Amide II groups of proteins reveal that the disease influences the secondary structure of proteins ending up with the formation of fibrils and amyloid type proteins. The ratio of the band [Amide I1650]:[Amide II1550] increases in patients with metastasis, and it is higher in the patients that underwent radiotherapy. The observed changes in the spectra conclude the increase in the formation of polyglycans where the inorganic mass of hydroxyapatite is reduced. The infrared spectra of cancerous bones showed the presence of calcium phosphate salts which decrease the bones’ mechanical properties. The substitution of phosphate groups of hydroxyapatite with carbonate shows that cancerous bones undergo an accelerated aging. The appearance of the bands at 830, 805 and 820 cm-1 suggests that B-, A-, and Z-DNA, respectively, are present. B-DNA is the native, A-DNA the denatured and Z-DNA predominates in cancerous bones.