Βιοαναλυτικοί Προσδιορισμοί σε Πραγματικό Χρόνο Χωρίς Επισήμανση Βασισμένοι στην Παρακολούθηση της Αντίθεσης Περιοδικών Σχηματισμών Πάνω σε Οξειδωμένο Πυρίτιο

Abstract

Στην παρούσα εργασία παρουσιάζουμε μια μέθοδο για σύνδεση μεταξύ πρωτεϊνών χωρίς επισήμανση, με βάση την πρωτεϊνικά προκληθείσα αντίθεση της εικόνας, ενός διαμορφωμένου υποστρώματος πυριτίου, που λαμβάνεται από μικροσκόπιο. Οι αντιδράσεις πραγματοποιούνται σε επιφάνεια διοξειδίου του πυριτίου, επικαλυμμένη με πολυμερικό υμένιο. Λαμβάνονται φωτογραφίες της επιφάνειας καθ' όλη τη διάρκεια και σε μικρά χρονικά διαστήματα, της τάξης των τεσσάρων δευτερολέπτων, με σκοπό να έχουμε καταγραφή της αντίδρασης σε πραγματικό χρόνο. Ο συντελεστής ανάκλασης του συστήματος διάλυμα-πρωτεΐνη-οξείδιο-πυρίτιο, λειτουργεί ως αποτέλεσμα του συνδυασμένου πάχους του οξειδίου και της πρωτεΐνης. Η παράγωγος του συντελεστή ανάκλασης αναφορικά με το πάχος της πρωτεΐνης, εξαρτάται από το πάχος του μήκους κύματος και το πάχος του οξειδίου. Αυτές οι παράμετροι, επιλέγονται με σκοπό τη μεγιστοποίηση του παραγόμενου μεγέθους της ανάκλασης, στις περιοχές του οξειδίου. Αντίθετα, στα σημεία που υπήρχε μόνο πυρίτιο, μετά την αφαίρεση του οξειδίου, ο συντελεστής ανάκλασης έχει τη μέγιστη τιμή του και μεταβάλλεται ελάχιστα με τη σύνδεση. Οι οξειδωμένες περιοχές αυξάνουν το συντελεστή ανάκλασης τους με την πρόσδεση της στρεπταβιδίνης και πλησιάζει την ανακλαστικότητα των γυμνών περιοχών. Αυτό έχει σαν αποτέλεσμα, η αντίθεση στις περιοδικές δομές με τη μορφή σκακιέρας, να πέφτει κατά τη διάρκεια του πειράματος. Το μέγεθος της πτώσης είναι συνέπεια της διαδικασίας βιομοριακής σύνδεσης.

A method is presented for label-free protein-protein binding based on the protein induced contrast modulation of the microscope image of a patterned silicon substrate. The reflection coefficient of the solution-protein-oxide-silicon stack is a function of the oxide-protein combined thickness. The derivative of th reflection coefficient with respect to the protein thickness depends on the wavelength range employed and the oxide thickness. These parameters are chosen to maximize the derivative magnitude on the oxide areas. On the contrary, on the bare silicon spots where the oxide was removed, the reflection coefficient, is at its maximum value and barely changes upon binding. For the parameters employed here, the oxidized areas increase their reflection coefficient upon streptavidin binding and approach the reflectivity of the bare areas. As a consequence, the contrast of the chessboard pattern drops during the experiment and the magnitude of the drop is a measure of the progress of the biomolecular reaction.