Πηκτινομεθυλεστεράση πορτοκαλιού Navel: απομόνωση, καθαρισμός και κινητική μελέτη απενεργοποίησης με υπερυψηλή υδροστατική πίεση

Abstract

Η επεξεργασία των τροφίμων με υπερυψηλή υδροστατική πίεση (ΥΥΠ) είναι μια νέα τεχνολογία επεξεργασίας τροφίμων η οποία επιτρέπει την απενεργοποίηση των παθογόνων και αλλοιογόνων μικροοργανισμών, καθώς και ενζύμων διατηρώντας παράλληλα τα οργανοληπτικά χαρακτηριστικά πρακτικά αναλλοίωτα. Η μέθοδος αυτή εφαρμόζεται για την επεξεργασία πληθώρας προϊόντων όπως φρέσκα φρούτα, λαχανικά και προϊόντα αυτών και έχει τη δυνατότητα να απενεργοποιήσει ενδογενή ένζυμα που προκαλούν αλλοιώσεις στην ποιότητα. Τέτοιο ένζυμο είναι και η πηκτινομεθυλεστεράση, που συναντάται σε όλα τα ανώτερα φυτά και είναι υπεύθυνη για τη μεταβολή της υφής των φρούτων και των λαχανικών καθώς και για την απώλεια θολότητας φρουτοχυμών. Η αναλυτική μελέτη των φυτικών ενζύμων ως προς τη δομή, τις βιοχημικές ιδιότητες και τη δραστικότητα απαιτεί την παραλαβή τους σε καθαρή μορφή από τους ιστούς των φυτών. Στην παρούσα εργασία απομονώθηκε και καθαρίστηκε πηκτινομεθυλεστεράση από το φλοιό πορτοκαλιών ποικιλίας Navel με σκοπό να μελετηθεί η επίδραση της θερμικής επεξεργασίας και της επεξεργασίας με ΥΥΠ στην κινητική απενεργοποίησης του ενζύμου. Ένα ισοένζυμο της ΠΜΕ απομονώθηκε από το φλοιό του πορτοκαλιού Navel, με διαδικασία που περιελάμβανε στάδια ομογενοποίησης, διήθησης, εξαλάτωσης, υπερδιήθησης καθώς και χρωματογραφία κατιοντοεναλλαγής και μοριακής διήθησης. Το ένζυμο παραλήφθηκε σε καθαρότητα μεγαλύτερη του 95% με ανάκτηση 9.5% της ενεργότητας του ανεπεξέργαστου εκχυλίσματος και ανηγμένη ενεργότητα 1125U/mg συνολικής πρωτεΐνης. Με ηλεκτροφόρηση πήγματος πολυακρυλαμιδίου (SDS-PAGE) προσδιορίστηκε το μοριακό του βάρος, ως μία μονή ζώνη στα 36kDa. Επιπρόσθετα, προσδιορίστηκαν οι κινητικές σταθερές Michaelis-Menten για την αντίδραση του ενζύμου με υπόστρωμα πηκτίνης (1% πηκτίνη DE=70-75%, 0.3M NaCl 30°C, pH=7.5) και βρέθηκαν Km=2.03mg/mL, Vm=5.18μmol/mL min. Η θερμική απενεργοποίηση του καθαρού ενζύμου (σε ρυθμιστικό διάλυμα 20mM Tris-HCl, pH=7.5) μελετήθηκε σε θερμοκρασίες 50, 55, 60 και 65 °C. Η απενεργοποίηση βρέθηκε ότι ακολουθεί κινητικό μοντέλο πρώτης τάξης με σταθερές ρυθμού απενεργοποίησης που κυμαίνονται μεταξύ 0.011 και 0.351min-1. Η εξάρτηση της σταθεράς του ρυθμού απενεργοποίησης από τη θερμοκρασία περιγράφηκε ικανοποιητικά από την εξίσωση Arrhenius με ενέργεια ενεργοποίησης που υπολογίστηκε ίση με 218kJ/mol. Η συνδυασμένη επεξεργασία του ενζύμου με ΥΥΠ και θερμοκρασία έγινε σε πιέσεις από 400 έως 700MPa και θερμοκρασίες 45, 50 και 55°C. Η κινητική απενεργοποίησης βρέθηκε να ακολουθεί εξίσωση πρώτης τάξης. Οι σταθερές του ρυθμού κυμαίνονται μεταξύ 0.012 και 0.2415 min-1 για τις εξεταζόμενες συνθήκες πίεσης και θερμοκρασίας. Παρατηρήθηκε συνεργιστική δράση της πίεσης και της θερμοκρασίας στην απενεργοποίηση του συγκεκριμένου ενζύμου. Η επίδραση της θερμοκρασίας στο ρυθμό απενεργοποίησης εκφράστηκε ικανοποιητικά μέσω της εξίσωσης Arrhenius. Οι ενέργειες ενεργοποίησης που υπολογίστηκαν κυμαίνονται μεταξύ 87 και 160kJ/mol για τις διάφορες πιέσεις επεξεργασίας. Αντίστοιχα, η επίδραση της πίεσης στο ρυθμό απενεργοποίησης εκφράστηκε ικανοποιητικά μέσω της σχέσης Eyring. Οι όγκοι ενεργοποίησης που υπολογίστηκαν κυμαίνονται μεταξύ -10.04 και -18.54mL/mol. Αρνητικοί όγκοι ενεργοποίησης δηλώνουν ότι αύξηση της πίεσης αυξάνει τη σταθερά του ρυθμού απενεργοποίησης στην ίδια θερμοκρασία. Η ενέργεια ενεργοποίησης βρέθηκε ότι αυξάνεται με αύξηση της πίεσης μέσω εκθετικής σχέσης, δηλαδή σε υψηλότερες πιέσεις η επίδραση της θερμοκρασίας στο ρυθμό απενεργοποίησης είναι μεγαλύτερη. Ο απόλυτος όγκος ενεργοποίησης βρέθηκε ότι αυξάνεται γραμμικά με τη θερμοκρασία, δηλαδή σε υψηλότερες θερμοκρασίες η επίδραση της πίεσης στο ρυθμό απενεργοποίησης είναι μεγαλύτερη. Για την έκφραση της συνδυασμένης επίδρασης πίεσης και θερμοκρασίας στο ρυθμό απενεργοποίησης αναπτύχθηκαν δύο μαθηματικά μοντέλα, ένα εκθετικό και ένα πολυωνυμικό. Οι παράμετροι των μοντέλων υπολογίστηκαν με μη γραμμική παλινδρόμηση στα πειραματικά δεδομένα. Και τα δύο μοντέλα έδωσαν ικανοποιητικό συντελεστή συσχέτισης (R2=0.995). Το εύρος ισχύος και των δύο μοντέλων είναι για πιέσεις 400-700MPa και θερμοκρασίες 45-55°C. Μέσα στο πεδίο αυτό η εκτίμηση των σταθερών ρυθμού απενεργοποίησης κρίνεται ικανοποιητική, αποδεικνύοντας ότι και τα δύο μοντέλα μπορούν να χρησιμοποιηθούν. Το εκθετικό μοντέλο υπερτερεί σε σχέση με το πολυωνυμικό στο ότι έχει πολύ μικρότερο αριθμό παραμέτρων και είναι συνεπώς πιο εύχρηστο. Σύγκριση που έγινε με αποτελέσματα επεξεργασίας με ΥΥΠ σε καθαρή ΠΜΕ από φλοιό πορτοκαλιού ποικιλίας Valencia αποκαλύπτει ότι η απενεργοποίηση και στα δύο ένζυμα ακολουθεί την ίδια συμπεριφορά ως προς την πίεση και τη θερμοκρασία, αλλά η ΠΜΕ του πορτοκαλιού Valencia είναι σημαντικά πιο θερμοευαίσθητη, με ρυθμό απενεργοποίησης στα 700MPa και 55°C κατά 4 φορές μεγαλύτερο από αυτόν της ΠΜΕ πορτοκαλιού Navel. Μελέτη φασματοσκοπίας κυκλικού διχρωισμού στην καθαρή ΠΜΕ φλοιού πορτοκαλιού Valencia αποκάλυψε έντονη σχέση μεταξύ απώλειας ενζυμικής δραστικότητας και μεταβολής δευτεροταγούς και τριτοταγούς δομής, μετά από επεξεργασία με ΥΥΠ. Είναι πολύ πιθανό αντίστοιχες μεταβολές να παρατηρηθούν και στην ΠΜΕ από φλοιό πορτοκαλιού Navel, παρατήρηση που δίνει έναυσμα για περαιτέρω μελέτη της σχέσης δομής-απενεργοποίησης του συγκεκριμένου ενζύμου.

Food processing with high hydrostatic pressure (HHP) is a new food processing technology which allows the inactivation of pathogenic and spoilage microorganisms and enzymes while maintaining the organoleptic characteristics of foods practically unchanged. The method is used to process a variety of products such as fresh fruits, vegetables and their products and has the ability to deactivate endogenous enzymes that cause deterioration in quality. One such enzyme is pectin methylesterase (PME), found in all higher plants and is responsible for texture modification of fruits and vegetables during ripening and for cloud loss in fruit juices. A detailed study of structure, biochemical properties and activity of plant enzymes requires them to be in highly purified form. In the present study PME from Navel cv. orange peel was isolated and purified in order to study the effect of heat treatment and treatment with HHP on the kinetics of enzyme inactivation. One isoenzyme of PME was isolated from the peel of Navel cv. orange, through procedure involving homogenization, filtering, precipitation, ultrafiltration, ion exchange chromatography and gel filtration chromatography. The enzyme was purified to purity greater than 95%, while recovering 9.5% of the enzyme activity of the crude extract and a specific activity of 1125U/mg total protein. The molecular weight of the enzyme was determined by Polyacrylamide gel electrophoresis (SDS-PAGE) as a single band at 36kDa. Kinetic constants of the enzyme-substrate reaction were also determined through the Michaelis-Menten equation. Using pectin as a substrate (1% pectin DE = 70-75%, 0.3M NaCl 30°C, pH=7.5) the constants were found to be Km=2.03mg/mL and Vm = 5.18mmol/mL min. Thermal inactivation of the pure enzyme (in buffer 20mM Tris-HCl, pH = 7.5) was studied at temperatures 50, 55, 60 and 65 ° C. The inactivation was found to follow first-order kinetics with inactivation rate constants ranging from 0.011 to 0.351min-1. The effect of temperature on the inactivation rate constant was well described by the Arrhenius equation with activation energy equal to 218kJ/mol. The combined heat-pressure inactivation of the purified enzyme was studied at pressures from 400 to 700MPa and at temperatures 45, 50 and 55 ° C. The inactivation kinetics were found to follow a first-order equation with inactivation rate constants ranging from 0.012 to 0.2415 min-1 for the given pressure and temperature conditions. A synergistic effect of pressure and temperature on the inactivation rate constants was observed. The effect of temperature on the inactivation rate was adequately expressed by the Arrhenius equation. The activation energies calculated lie between 87 and 160kJ/mol for various processing pressures. Similarly, the effect of pressure on the inactivation rate was adequately expressed through the Eyring equation. The calculated activation volumes range from -10.04 to -18.54mL/mol. Negative activation volumes indicate that an increase in pressure increases the inactivation rate constant at the given temperature. The activation energy was found to increase exponentially with increasing pressure, i.e. at higher pressures the effect of temperature on the rate of inactivation is more pronounced. Similarly, the absolute inactivation volume was found to increase linearly with temperature, i.e. at higher temperatures the effect of pressure on the rate of inactivation is more pronounced. To express the combined effect of pressure and temperature on the inactivation rate constant two mathematical models were used, an exponential and a polynomial. The parameters of each model were calculated by nonlinear regression of the experimental data. Both models gave good correlation coefficient (R2 = 0.995). The range of validity of both models is for pressures in the range of 400-700MPa and temperatures in the range of 45-55°C. In this range, the estimated inactivation rate constants are satisfactory, confirming the validity of both models. The exponential model however is superior compared to the polynomial in that it contains far fewer parameters and is therefore much simpler. Comparing the results obtained from combined thermal-HHP inactivation of purified orange PME from Navel cv. orange peel and Valencia cv. orange peel reveals that both enzymes display the same inactivation behavior with temperature and pressure. The PME obtained from the Valencia orange, however, is significantly more temperature sensitive, with an inactivation rate constant at 700MPa and 55 ° C 4 times greater than that of the Navel orange PME at the same conditions. Circular dichroism spectroscopy on purified PME from Valencia cv. orange peel has revealed a strong correlation between loss of enzyme activity and changes in secondary and tertiary structure after treatment with HHP. It is very likely that similar changes may occur in the PME of Navel orange peel, an observation which implies the necessity for further study on the structure-inactivation relationship of this enzyme.