Αξιοποίηση βιομάζας δασικής προέλευσης για την
παραγωγή ολιγοσακχαριτών με πρεβιοτική δράση

Κρικιγιάννη, Ελένη; Krikigianni, Eleni

dc.contributor.author	Κρικιγιάννη, Ελένη	el
dc.contributor.author	Krikigianni, Eleni	en
dc.date.accessioned	2020-05-13T13:17:35Z
dc.date.available	2020-05-13T13:17:35Z
dc.identifier.uri	https://dspace.lib.ntua.gr/xmlui/handle/123456789/50545
dc.identifier.uri	http://dx.doi.org/10.26240/heal.ntua.18243
dc.rights	Αναφορά Δημιουργού-Μη Εμπορική Χρήση-Όχι Παράγωγα Έργα 3.0 Ελλάδα	*
dc.rights	Αναφορά Δημιουργού-Μη Εμπορική Χρήση-Όχι Παράγωγα Έργα 3.0 Ελλάδα	*
dc.rights.uri	http://creativecommons.org/licenses/by-nc-nd/3.0/gr/	*
dc.subject	Πρεβιοτικά-ολιγοσακχαρίτες-κελλοβιόζη-ενζυμική υδρόλυση-δασική βιομάζα	el
dc.subject	Prebiotics-oligosaccharides-cellobiose-enzymatic hydrolysis- forest biomass	en
dc.title	Αξιοποίηση βιομάζας δασικής προέλευσης για την παραγωγή ολιγοσακχαριτών με πρεβιοτική δράση	el
dc.title	Food grade oligosaccharides with high prebiotic value from forest biomass	en
heal.type	bachelorThesis
heal.classification	Βιοτεχνολογία	el
heal.classification	Biotechnology	en
heal.language	en
heal.access	free
heal.recordProvider	ntua	el
heal.publicationDate	2019-10-28
heal.abstract	Prebiotics have been defined as “non-digestible food ingredients that selectively promote the growth and the activity of the beneficial bacteria that exist in the colon” and own a big market share in the food and pharmaceutical industries. However, more and more effort is dedicated in the development of novel, sustainable and cost-competitive ingredients that can be used in the functional food product market. The purpose of this thesis is to expand the already existing knowledge regarding the non-digestible oligosaccharides (NDOs) with prebiotic potential by taking advantage of the unexploited high abundant lignocellulosic residues. Therefore, the main focus of this study is on the efficient production of cello-oligosaccharides (COS) through enzymatic hydrolysis process using forest biomass. Firstly, the key enzymes that were used for the lignocellulose degradation were originally encoded by T. thermophila and expressed heterologously in the methylotrophic P.pastoris yeast. Particularly, when the endoglucanase TtEG5 (75 kDa), the exoglucanase TtCBH7 (80 kDa) and the oxidative enxyme TtLPMO (60 kDa) were combined, an increase in the enzymatic hydrolysis yields was observed. The combined action of the above enzymatic mixture was then improved with the addition of a processive cellobiohydrolase, PaCbh6A, that was chosen after showing a good lignocellulolytic potential among the 14 commercial cellulases that were studied. The defined enzymatic mixture was afterwards optimized towards organosolv pretreated hardwood (birch) and softwood (spruce) substrates so as to maximize the cellobiose yields. In order to produce significant amounts of COS larger scale reactions (6 % initial concentration of the substrate) using the two types of forest residues were carried out, where the cellobiose yield was 2-fold higher using birch as substrate (19.2 %) than using spruce (9.6 %). The hydrolysis products were recovered with pressure driven membrane processes prior to testing their prebiotic ability. Among the gut related bacteria (bifidobacteria and lactobacilli) that were used as probiotic strains, only two of the lactobacillus genus (L. gasseri and L .plantarum) proved to efficiently use pure cellobiose as a carbon source, with L. plantarum showing the highest growth rate (μ=0.407 h-1). Finally, the lignocellulose-derived COS had a different outcome on the growth of the two lactobacilli strains that was dependent on the biomass type that was used. Particularly, only the birch-derived COS proved to be an efficient carbohydrate source for the growth of both lactobacilli strains, while spruce-derived COS resulted in a minor growth of only the L. plantarum strain (μ=0.039 h-1). The evaluation of the prebiotic potential of lignocellulose-derived COS is a biotechnological application of interdisciplinary nature and remains to be further tested in order to obtain a holistic aspect.	en
heal.abstract	Τα πρεβιοτικά έχουν οριστεί ως «μη-πεπτόμενα συστατικά τροφίμων που ενισχύουν επιλεκτικά την ανάπτυξη και τη δραστηριότητα των ωφέλιμων βακτηρίων του παχέος εντέρου» και κατέχουν μεγάλο μερίδιο αγοράς στη βιομηχανία τροφίμων και στις φαρμακοβιομηχανίες. Ωστόσο, όλο και περισσότερη προσπάθεια καταβάλλεται για την ανάπτυξη καινοτόμων, βιώσιμων και ανταγωνιστικών συστατικών που μπορούν να εφαρμοστούν στην αγορά των λειτουργικών προϊόντων τροφίμων. Ένας συγκεκριμένος τύπος διατροφικών υδατανθράκων, οι άπεπτοι ολιγοσακχαρίτες (NDOs) έχουν κατεξοχήν ρόλο σε αυτή την κατηγορία συστατικών και θεωρούνται ιδανικό θρεπτικό υπόστρωμα για την ανάπτυξη και βελτίωση της ωφέλιμης εντερικής βακτηριακής χλωρίδας, δηλαδή των προβιοτικών βακτηρίων. Η επωφελής σημασία των προβιοτικών έχει παρατηρηθεί εδώ και πολλά χρόνια με τη χρήση τους στη βακτηριακή ζύμωση του γάλακτος. Η εντερική βακτηριακή χλωρίδα και συγκεκριμένα του παχέος εντέρου αποτελεί περίπου το 95 % του συνολικού αριθμού κυττάρων στο ανθρώπινο σώμα και περιέχει πάνω από 500 διαφορετικά είδη βακτηρίων. Συνεπώς, παίζει πολύ σημαντικό ρόλο στη διατήρηση της υγείας του ανθρώπου, ενώ διαταραχές στη σύνθεσή της συνδέονται με την πρόκληση ορισμένων γαστρεντερικών ασθενειών, ακόμα και νόσων. Μερικές από αυτές είναι οι ιογενείς διάρροιες, το σύνδρομο του ευερέθιστου εντέρου, οι φλεγμονώδεις νόσοι (ασθένεια του Κρον) ακόμα και καρκίνος του παχέος εντέρου. Η συνδυασμένη δράση των προβιοτικών βακτηρίων με τα κατάλληλα πρεβιοτικά συστατικά, που εμπεριέχεται στον όρο «συμβιοτικά», παρέχει μια ενισχυμένη προσέγγιση στη διατήρηση μιας ισορροπημένης εντερικής βακτηριακής χλωρίδας. Τα πιο γνωστά πρεβιοτικά συστατικά είναι οι φρουκτο-ολιγοσακχαρίτες (FOS), οι γαλακτο-ολιγοσακχαρίτες (GOS) και οι ξυλο-ολιγοσακχαρίτες (XOS) που ανήκουν στην κατηγορία των άπεπτων ολιγοσακχαριτών (NDOs). Οι άπεπτοι ολιγοσακχαρίτες είναι ολιγοσακχαρίτες με βαθμό πολυμερισμού 2-10 και η πρεβιοτική τους δράση ορίζεται από την ικανοποίηση ορισμένων χαρακτηριστικών, όπως είναι η ανθεκτικότητα στο γαστρικό υγρό και η αντίσταση στην υδρόλυση από τα ένζυμα του πεπτικού σωλήνα, ο μεταβολισμός τους από τα βακτήρια της εντερικής βακτηριακής χλωρίδας και τελικά η παραγωγή θρεπτικών συστατικών. Τελευταία έχει δοθεί προσοχή στους άπεπτους ολιγοσακχαρίτες με πρεβιοτική δράση που προέρχονται από την υδρόλυση της κυτταρίνης, τους λεγόμενους κελλο-ολιγοσακχαρίτες (COS). Αυτό που δίνει μεγάλη σημασία στους κελλο-ολιγοσακχαρίτες (COS) είναι ότι προέρχονται από την κυτταρίνη, που είναι η πιο διαδεδομένη οργανική ένωση στη Γη και αποτελεί το κύριο συστατικό του φυτικού κυτταρικού τοιχώματος. Επιπλέον, αποτελεί το βασικότερο συστατικό της λιγνινοκυτταρινούχας βιομάζας, η οποία αποτελείται επίσης από ημικυτταρίνη και λιγνίνη και είναι μια ανεξάντλητη, ανανεώσιμη και εναλλακτική πρώτη ύλη. Συνεπώς, η αξιοποίησή της για την παραγωγή χρήσιμων και υψηλής διατροφικής σημασίας σακχάρων καθίσταται ιδιαίτερα ελκυστική. Η σακχαροποίηση της λιγνινοκυτταρινούχας βιομάζας προκύπτει από μια σειρά διεργασιών που ξεκινάει με την προκατεργασία της βιομάζας που έχει ως αποτέλεσμα τη διάσπαση της άκαμπτης κρυσταλλικής δομής της και την αποδόμηση των βασικών συστατικών της, με στόχο την απομάκρυνση της ημικυτταρίνης και λιγνίνης, έτσι ώστε να διευκολυνθεί η μετέπειτα υδρόλυση της κυτταρίνης. Η υδρόλυση της κυτταρίνης με στόχο το σχηματισμό κελλοβιόζης επιτυγχάνεται με την δράση ειδικών ενζύμων, των κυτταρινασών, που μπορούν να παραχθούν από ορισμένους μικροοργανισμούς, κυρίως βακτήρια και μύκητες. Οι κυτταρινάσες αποτελούν ένα πολυσύνθετο ενζυμικό σύστημα όπου τα βασικά ένζυμα δρουν συνεργιστικά με στόχο την αποικοδόμηση της κυτταρίνης. Συγκεκριμένα, η β-1,4-ενδογλουκανάση (ΕG) αποικοδομεί με τυχαίο τρόπο τις άμορφες περιοχές της κυτταρίνης δημιουργώντας ελεύθερα άκρα στην αλυσίδα (αναγωγικά και μη αναγωγικά), ενώ οι β-1,4-εξωγλουκανάσες ή κελλοβιοϋδρολάσες (CBH) απελευθερώνουν μόρια κελλοβιόζης από τα άκρα. Η απόδοση της ενζυμικής υδρόλυσης αυξάνεται με την παρουσία ενός εξειδικευμένου ενζυμικού μίγματος, γι’ αυτό και οι σύγχρονες μελέτες εστιάζουν στην ανεύρεση νέων συστατικών που θα συμμετέχουν στη δημιουργία ενισχυμένων ενζυμικών κοκτέιλ. Το ένζυμο λυτική μονοοξυγενάση των πολυσακχαριτών (Lytic polysaccharide monooxygenase, LPMO) με οξειδωτική ικανότητα έχει αποδειχθεί ότι δρα σε συνεργασία με τις κυτταρινάσες για την αποτελεσματική αποικοδόμηση της λιγνινοκυτταρινούχας βιομάζας οπότε αποτελεί βασικό ένζυμο για την παρούσα εργασία. Μια ειδική κατηγορία ενζύμων, οι «επεξεργαστικές» (processive) κυτταρινάσες, έχουν το πλεονέκτημα να προσδένονται ισχυρά στην κυτταρική αλυσίδα και να καταλύουν διαδοχικές υδρολύσεις προτού αποδεσμευτούν από το υπόστρωμα, αυξάνοντας την υδρολυτική απόδοση. Συνεπώς, η συμμετοχή τους στη δημιουργία ενζυμικών κοκτέιλ με ενισχυμένη δράση κρίνεται απαραίτητη. Ο στόχος της παρούσας διπλωματικής εργασίας είναι να επεκτείνει την ήδη υπάρχουσα γνώση σχετικά με τους άπεπτους ολιγοσακχαρίτες (NDOs) με δυνητικά πρεβιοτική δράση αξιοποιώντας την άφθονη ανεκμετάλλευτη λιγνοκυτταρινούχα βιομάζα. Επομένως, η συγκεκριμένη μελέτη εστιάζει στην αποτελεσματική παραγωγή κελλο-ολιγοσακχαριτών (COS) μέσω της διεργασίας της ενζυμικής υδρόλυσης της δασικής βιομάζας. Αρχικά, τα βασικά ένζυμα που χρησιμοποιήθηκαν για την αποικοδόμηση της λιγνοκυτταρινούχας βιομάζας παράχθηκαν ετερόλογα από τη μεθυλότροφη ζύμη P. Pastoris ενώ προήλθαν από το γονιδίωμα του μύκητα T. thermophila. Συγκεκριμένα, με το συνδυασμό της ενδογλουκανάσης (TtEG5) (75 kDa), της εξωγλουκανάσης TtCBH7 (80 kDa) και του ενζύμου με οξειδωτική δράση TtLPMO (60 kDa) παρατηρείται αυξημένη απόδοση της ενζυματικής υδρόλυσης. Στη συνέχεια, η συνδυασμένη δράση του παραπάνω ενζυμικού μίγματος βελτιώθηκε με την προσθήκη ενός «επεξεργαστικού ενζύμου» (processive), της κελλοβιοϋδρολάσης PaCbh6A, που επιλέχθηκε αφού έδειξε καλή λιγνοκυτταρινολυτική ικανότητα ανάμεσα στις 14 εμπορικές κυτταρινάσες που εξετάσθηκαν. Έπειτα, το συγκεκριμένο μίγμα ενζύμων βελτιστοποιήθηκε με τη χρήση στατιστικού μοντέλου ως προς τον καλύτερο συνδυασμό που θα μεγιστοποιήσει την απόδοση της υδρόλυσης των προκατεργασμένων λιγνοκυτταρινούχων υποστρωμάτων (σημύδα και έλατο). Προκειμένου να παραχθούν σημαντικές ποσότητες κελλο-ολιγοσακχαριτών (COS) πραγματοποιήθηκαν υδρολύσεις μεγαλύτερης κλίμακας (6 % αρχική συγκέντρωση υποστρώματος) χρησιμοποιώντας τα δύο είδη δασικών υπολειμμάτων, όπου προέκυψε ότι η απόδοση της κελλοβιόζης ήταν διπλάσια με τη χρήση της σημύδας ως υπόστρωμα (19.2 %) συγκριτικά με τη χρήση του ελάτου (9.6 %). Τα προϊόντα της υδρόλυσης ανακτήθηκαν με διεργασίες υπό πίεση φιλτραρίσματος μέσω μεμβράνης προτού δοκιμαστεί η πρεβιοτική τους δράση. Τα προβιοτικά στελέχη που χρησιμοποιήθηκαν ανήκουν στην κατηγορία βακτηρίων της εντερικής χλωρίδας (μπιφιδοβακτήρια και γαλακτοβάκιλλοι) ενώ τελικά μόνο δύο στελέχη του είδους των λακτοβακίλλων (L. gasseri and L. plantarum) αποδείχθηκε ότι μπορούν να χρησιμοποιήσουν την καθαρή κελλοβιόζη ως πηγή άνθρακα, με το στέλεχος L. Plantarum να έχει το μεγαλύτερο ρυθμό ανάπτυξης (μ=0.407 h-1). Τέλος, η ανάπτυξη των επιλεγμένων προβιοτικών στελεχών του είδους των λακτοβακίλλων εμφάνισε διαφορετική συμπεριφορά ανάλογα με τη λιγνοκυτταρινούχα προέλευση των κελλο-ολιγοσακχαριτών (COS). Συγκεκριμένα, μόνο οι κελλο-ολιγοσακχαρίτες που προήλθαν με τη χρήση της σημύδας ως υπόστρωμα αποτέλεσαν καλή πηγή άνθρακα για την ανάπτυξη και των δύο στελεχών, ενώ εκείνοι που προήλθαν με τη χρήση ελάτου ως υπόστρωμα προώθησαν ελάχιστα την ανάπτυξη μόνο του στελέχους L. plantarum (μ=0.039 h-1). Η παρατήρηση αυτή συνδέεται με τη διαφορετική σύσταση των προκατεργασμένων δασικών υποστρωμάτων. Ειδικότερα, στην περίπτωση του προκατεργασμένου ελάτου παρατηρείται μεγαλύτερο ποσοστό εναπομένουσας λιγνίνης (14.9 %) συγκριτικά με την προκατεργασμένη σημύδα (7.1 %). Η λιγνίνη που έχει παραμείνει στο λιγνοκυτταρινούχο υπόστρωμα δρα παρεμποδιστικά όχι μόνο στη δράση των κυτταρινασών, μειώνοντας την απόδοση της ενζυμικής υδρόλυσης, αλλά και στη μετέπειτα ζύμωση των παραγόμενων σακχάρων από τα βακτηριακά στελέχη. Η αναστολή της βακτηριακής ανάπτυξης οφείλεται στην ύπαρξη των φαινολικών ενώσεων που σχηματίζονται κατά τη διάρκεια της προκατεργασίας της πρώτης ύλης, αλλά και πιθανότατα κατά το στάδιο της σακχαροποίησης. Η αξιοποίηση βιομάζας δασικής προέλευσης για την παραγωγή ολιγοσακχαριτών με πρεβιοτική δράση είναι μια βιοτεχνολογική εφαρμογή διεπιστημονικής φύσης και παραμένει ανοιχτή η δυνατότητα της περαιτέρω μελέτης της έτσι ώστε να αποκτηθεί μια ολοκληρωμένη άποψη.	el
heal.advisorName	Τόπακας, Ευάγγελος	el
heal.advisorName	Topakas, Evangelos	en
heal.committeeMemberName	Τόπακας, Ευάγγελος	el
heal.committeeMemberName	Κέκος, Δημήτριος	el
heal.committeeMemberName	Τσόπελας, Φώτιος	el
heal.committeeMemberName	Topakas, Evangelos	en
heal.committeeMemberName	Kekos, Dimitrios	en
heal.committeeMemberName	Tsopelas, Fotios	en
heal.academicPublisher	Εθνικό Μετσόβιο Πολυτεχνείο. Σχολή Χημικών Μηχανικών. Τομέας Σύνθεσης και Ανάπτυξης Βιομηχανικών Διαδικασιών (IV)	el
heal.academicPublisherID	ntua
heal.numberOfPages	122 σ.	el
heal.fullTextAvailability	false