Εναλλακτικές μέθοδοι εκχύλισης φυτικών λιπαρών και βιοδραστικών συστατικών τους

Abstract

Ο ελαιοπυρήνας είναι το στερεό παραπροϊόν που προκύπτει κατά την εξαγωγή του ελαιόλαδου από φυγοκεντρικά συστήματα δύο ή τριών φάσεων. Πρόκειται για ένα υλικό χαμηλού κόστους που παράγεται σε σημαντικές ποσότητες και έως τώρα χρησιμοποιείται για την ανάκτηση του περιεχόμενου ελαίου (πυρηνέλαιου) σε μικρής κλίμακας βιομηχανικές μονάδες. Το πυρηνέλαιο εμφανίζει παρόμοια σύσταση με το ελαιόλαδο, έχει όμως υψηλότερη περιεκτικότητα σε ασαπωνοποίητα συστατικά από αυτό, και ειδικότερα είναι πλουσιότερο σε ορισμένες στερόλες (β-σιτοστερόλη) και σε σκουαλένιο - συστατικά που διαθέτουν αξιόλογη βιολογική δράση. Ο ελαιοπυρήνας όμως, εκτός από πηγή ελαίου, αποτελεί επιπλέον σημαντική πηγή και άλλων βιοδραστικών συστατικών, όπως τα φαινολικά συστατικά. Τα τελευταία χρόνια, έχει προταθεί η ανάκτηση αυτών των βιοδραστικών συστατικών, τα οποία μπορούν να χρησιμοποιηθούν ως αντιοξειδωτικοί και αντιμικροβιακοί παράγοντες σε συστήματα τροφίμων, φαρμάκων και καλλυντικών. Σκοπός της παρούσας διδακτορικής διατριβής ήταν η αξιολόγηση καινοτόμων εναλλακτικών μεθόδων εκχύλισης έναντι της συμβατικής (με οργανικό διαλύτη) για την παραλαβή τόσο πυρηνέλαιου εμπλουτισμένου ποιοτικά σε βιοδραστικά συστατικά, όπως στερόλες και σκουαλένιο, όσο και για την παραλαβή φαινολικών συστατικών, όπως κυρίως ελευρωπαΐνης, υδροξυτυροσόλης και ρουτίνης, απευθείας από τον ελαιοπυρήνα που μπορούν να ενσωματωθούν σε συστήματα τροφίμων και να προσφέρουν συγχρόνως οφέλη στην ανθρώπινη υγεία. Η εκχύλιση με χρήση οργανικού διαλύτη μελετήθηκε ως η πλέον καθιερωμένη μέθοδος στη βιομηχανία τροφίμων για την ανάκτηση ελαίου από ελαιούχους σπόρους. Ο ελαιοπυρήνας είχε αρχική περιεκτικότητα σε υγρασία 45% w/w, ξ.β. και 4,5% w/w, ξ.β. μετά την ξήρανσή του, και αλέστηκε σε μέγεθος 1 mm. Πραγματοποιήθηκε κινητική μελέτη και μοντελοποίηση της διεργασίας της εκχύλισης για την παραλαβή του πυρηνέλαιου τόσο ως προς την ποσοτική απόδοσή του όσο και ως προς το περιεχόμενο ασαπωνοποίητο υλικό του (USM% ελαίου). Οι εκχυλίσεις της κινητικής μελέτης πραγματοποιήθηκαν σε κλίμακα μεγέθους ξηρού ελαιοπυρήνα 25 g και με χρήση εξανίου ως διαλύτη, με σκοπό να διερευνηθούν οι κυριότεροι παράγοντες που επηρεάζουν τη διεργασία, όπως η θερμοκρασία (Τ=40-60 °C), η αναλογία στερεού/υγρού (S:L=1:4-1:12 g:mL), η ταχύτητα ανάδευσης (AS=100-800 rpm) και ο χρόνος εκχύλισης (t=1-60 min), καθώς και να εκτιμηθεί μαθηματικά η εξέλιξη της διεργασίας που επηρεάζει το κόστος της διεργασίας και να καταλήξει εάν είναι δυνατή η εφαρμογή της σε βιομηχανική κλίμακα. Από τα αποτελέσματα της εκχύλισης διερευνήθηκε ο μηχανισμός μεταφοράς μάζας του ελαίου, αλλά και του ασαπωνοποίητου υλικού του στο διαλύτη και βρέθηκε ότι κατά το πρώτο στάδιο της εκχύλισης επικρατεί η ταχεία απομάκρυνση του ελαίου 24 από την εξωτερική επιφάνεια του σπόρου κατά την έκλουσή του με το εξάνιο (washing step), ενώ στη συνέχεια, ο ρυθμός εκχύλισης μειώνεται σημαντικά, καθώς η διάχυση αποτελεί το κυρίαρχο φαινόμενο που διέπει το στάδιο αυτό (diffusion step). Τα πειραματικά δεδομένα για το έλαιο και το ασαπωνοποίητο υλικό του (USM% ελαίου) χρησιμοποιήθηκαν για την εκτίμηση των μεταβλητών δύο μαθηματικών μοντέλων: του μοντέλου των So & Macdonald, (1986): και του μοντέλου των Sulaiman et al. (2013):. Όσον αφορά την κινητική μελέτη εκχύλισης του ελαίου και του ασαπωνοποίητου υλικού του, τα πειραματικά δεδομένα είχαν πολύ καλή προσαρμογή στο μοντέλο των So & Macdonald (1986) παρέχοντας υψηλές τιμές συντελεστή προσδιορισμού (R2>0,996) και χαμηλές τιμές σχετικής απόκλισης (0,40<ARD<3,05). Ωστόσο, το μοντέλο των Sulaiman et al. (2013) παρείχε χαμηλότερες τιμές του συντελεστή προσδιορισμού (R2>0,981) και υψηλότερες τιμές σχετικής απόκλισης (3,75<ARD<5,73). Από τις τιμές των συνθηκών που εξετάστηκαν, και από τα δύο μοντέλα προέκυψε ότι υψηλότερες τιμές θερμοκρασίας (60°C), αναλογίας υγρού:στερεού (12:1 mL/g) και ταχύτητας ανάδευσης (800 rpm) οδήγησαν σε αυξημένη απόδοση ελαίου (5,83-7,11% ελαιοπυρήνα ξ.β.) και ευνόησαν την εκχύλιση του ασαπωνοποίητου υλικού στο εκχυλιζόμενο έλαιο (USM=3,40-4,23% ελαίου), ενώ παράλληλα αύξησαν τους συντελεστές μεταφοράς μάζας (kw, kd για το μοντέλο των So& Macdonald και k·α για το μοντέλο των Sulaiman et al.) κατά την εκχύλιση. Οι μεταβλητές του κινητικού μοντέλου των So & Macdonald (1986) για την εκχύλιση τόσο του ελαίου όσο και του ασαπωνοποίητου υλικού του σε διαφορετικές συνθήκες (θερμοκρασίας-Τ, αναλογίας στερεού:υγρού-S:L και ταχύτητας ανάδευσης-AS), επαλήθευσαν και πάλι την επικράτηση του σταδίου της έκπλυσης σε σχέση με το στάδιο της διάχυσης, δεδομένου ότι οι συντελεστές έκπλυσης (1,05<kw<2,27) βρέθηκαν υψηλότεροι από τους συντελεστές διάχυσης (0,11<kd<0,21). Οι τιμές της μεταβολής της ενθαλπίας (ΔΗ) και της εντροπίας (ΔS) βρέθηκαν θετικές, ενώ οι τιμές της μεταβολής της ελεύθερης ενέργειας Gibbs (ΔG) ήταν αρνητικές, υποδεικνύοντας ότι η διεργασία ήταν ενδόθερμη, μη αντιστρεπτή και αυθόρμητη. Στις συνθήκες ισορροπίας, η απόδοση της εκχύλισης σε έλαιο αυξάνεται κατά ένα συντελεστή περίπου 1,096 και 1,054 για τα μοντέλα των So& Macdonald και των Sulaiman et al., αντίστοιχα, για κάθε 10 °C αύξηση της θερμοκρασίας. Το κινητικό μοντέλο που προτάθηκε από τους So & Macdonald (1986) χρησιμοποιήθηκε για τη συσχέτιση των πειραματικών δεδομένων για τα επιλεγμένα βιοδραστικά συστατικά του ασαπωνοποίητου υλικού του πυρηνέλαιου, όπως το σκουαλένιο και τις κύριες στερόλες (β-σιτοστερόλη, καμπεστερόλη, στιγμαστερόλη) (mg/g ελαίου), με τις ίδιες παραμέτρους της εκχύλισης (Τ=40-60 °C, S:L=1:4-1:12 g/mL, AS=100-800 rpm, και t=1-60 min). Όπως συνέβη και στην εκχύλιση του ελαίου και του ασαπωνοποίητου υλικού του, έτσι και η κινητική των επιμέρους αυτών συστατικών χαρακτηρίζεται από ένα ταχύ στάδιο έκπλυσης και ένα ακόλουθο 25 βραδύτερο στάδιο διάχυσης, το οποίο φθάνει σε ισορροπία ανάλογα με τη βιοδραστική ουσία του ασαπωνοποίητου υλικού. Όσον αφορά τις μεταβλητές του κινητικού μοντέλου εκχύλισης για το σκουαλένιο, τη β-σιτοστερόλη, τη στιγμαστερόλη και την καμπεστερόλη σε διαφορετικές συνθήκες (T, S:L, AS) αποδείχθηκε και πάλι η επικράτηση του σταδίου έκπλυσης σε σχέση με το στάδιο της διάχυσης, δεδομένου ότι οι συντελεστές έκπλυσης (kw) ήταν υψηλότεροι από τους αντίστοιχους για το στάδιο της διάχυσης (kd). Από τις τιμές που εξετάστηκαν, υψηλότερες τιμές θερμοκρασίας (60 °C), αναλογίας υγρού/στερεού (12:1 mL/g) και ταχύτητας ανάδευσης (800 rpm) οδήγησαν σε αυξημένη συγκέντρωση β-σιτοστερόλης (0,81-1,18 mg/g ελαίου), καμπεστερόλης (0,16-0,20 mg/g ελαίου), στιγμαστερόλης (0,10-0,14 mg/g ελαίου) και σκουαλένιου (3,95-4,20 mg/g ελαίου) στα εκχυλιζόμενα έλαια. Ακολούθως εξετάστηκε η εκχύλιση με χρήση συν-διαλύτη με σκοπό την ανάκτηση και άλλων συστατικών διαφορετικής πολικότητας. Ως συν-διαλύτης χρησιμοποιήθηκε η ισοπροπυλική αλκοόλη και αξιολογήθηκαν διάφορα μίγματα εξανίου (Η): ισοπροπανόλης (Ι) σε διαφορετικές αναλογίες (Η:I=3:1, Η:I=3:2, H:Ι=4:1, Η:Ι=9:1) ως προς την απόδοσή τους σε έλαιο, όπως και στο ασαπωνοποίητο υλικό, και τις κύριες στερόλες και το σκουαλένιο στο εκχυλιζόμενο έλαιο. Οι εκχυλίσεις πραγματοποιήθηκαν σε συσκευή Soxhlet με κλίμακα μεγέθους ξηρού ελαιοπυρήνα 25 g με μέγεθος σωματιδίων (PS) 1 mm και αναλογία στερεού/υγρού (S:L) 1:8 g/mL για 8 h. Μεταξύ των μιγμάτων διαλυτών που εξετάστηκαν, το μίγμα Η:Ι=3:2 εμφάνισε την υψηλότερη ανάκτηση ελαίου (13,70% ελαιοπυρήνα ξ.β.), τη μεγαλύτερη ποσότητα ασαπωνοποίητου υλικού στο εκχυλιζόμενο έλαιο (USM=4,92% ελαίου) και υψηλές περιεχόμενες στερόλες και σκουαλένιο (σύνολο σε ολικές προσδιοριζόμενες στερόλες: 1,706 mg/g ελαίου, σκουαλένιο: 5,217 mg/g ελαίου). Στα πλαίσια της διερεύνησης «φιλικών προς το περιβάλλον» μεθόδων εκχύλισης που παρέχουν αποτελεσματική και εκλεκτική εκχύλιση ελαίου προστατεύοντας ταυτόχρονα την υποβάθμιση των βιοδραστικών συστατικών, εφαρμόστηκε η εκχύλιση υποβοηθούμενη με υπέρηχους (UAE) τόσο για την παραλαβή του πυρηνέλαιου αλλά και για την ανάκτηση των βιοδραστικών συστατικών του ασαπωνοποίητου υλικού του όπως των στερολών και του σκουαλένιου. Με τη μεθοδολογία των αποκριτικών επιφανειών (RSM) και τον πειραματικό σχεδιασμό Box-Behnken προσδιορίστηκαν οι πολυωνυμικές εξισώσεις που συσχετίζουν την απόδοση σε έλαιο, όπως και το ασαπωνοποίητο υλικό (USM%), το ολικό περιεχόμενο των φαινολικών συστατικών (TPC) και την αντιοξειδωτική δράση (DPPH) του εκχυλιζόμενου πυρηνέλαιου με τις παραμέτρους της διεργασίας (T=40-60 °C, S:L=1:4-1:12 g/mL και PS=0,5-2 mm). Οι εκχυλίσεις πραγματοποιήθηκαν με κλίμακα μεγέθους ξηρού ελαιοπυρήνα 25 g και με προκαθορισμένο όγκο εξανίου σε λουτρό υπερήχων για διάρκεια 1 h. Η μέγιστη απόδοση σε έλαιο (11,22% ελαιοπυρήνα ξ.β.) επιτεύχθηκε με T= 60 °C, S:L= 1:12 g/mL και PS= 0,5 mm. Η μέγιστη τιμή του USM% του ελαίου ήταν 4,50% και επιτεύχθηκε στις βέλτιστες συνθήκες 26 T=55 °C, S:L=1:12 g/mL και PS=0,5 mm. Η μέγιστη τιμή του TPC του πυρηνέλαιου ήταν 0,261 mg GA/g ελαίου και επιτεύχθηκε με εκχύλιση του ελαιοπυρήνα σε συνθήκες: Τ=50 °C, S:L=1:8 g/mL και PS= 0,9 mm. Η μέγιστη αντιοξειδωτική δράση (DPPH) του πυρηνέλαιου βρέθηκε ως 0,211 mg Trolox/g ελαίου και επιτεύχθηκε σε T= 55 °C, S:L=1:8 g/mL και PS= 0,9 mm. Μέσω του μοντέλου εξετάστηκε και η αριστοποίηση της ανάκτησης των κυριότερων στερολών (β-σιτοστερόλη, καμπεστερόλη και στιγμαστερόλη) και του σκουαλένιου που αποτελούν τα κύρια συστατικά του ασαπωνοποίητου κλάσματος του ελαίου και η επίδραση των βασικών παραμέτρων εκχύλισης (T=40-60 °C και S:L=1:4-1:12 g/mL). Η μέγιστη τιμή της συγκέντρωσης της β-σιτοστερόλης βρέθηκε 1,399 mg/g σε συνθήκες T=60 °C και S:L=1:12 g/mL. Η μέγιστη τιμή της συγκέντρωσης της καμπεστερόλης ήταν 0,220 mg/g και επιτεύχθηκε σε Τ= 55 °C για S:L=1:10 g/mL. Η μέγιστη τιμή της συγκέντρωσης της στιγμαστερόλης βρέθηκε 0,105 mg/g, με εφαρμογή T=50 °C και S:L=1:12 g/mL. Περαιτέρω, η μέγιστη τιμή της συγκέντρωσης του σκουαλένιου βρέθηκε 4,575 mg/g σε T=60 °C και S:L=1:12 g/mL. Επιπλέον δοκιμάστηκε και ο συνδυασμός της χρήσης του μίγματος Η:Ι = 3:2 και της εφαρμογής υπερήχων στις βέλτιστες συνθήκες (Τ=50-60 °C, S:L=1:12 g/mL, t=1 h), ωστόσο έδειξε παρόμοια αποτελέσματα με εκείνα που προέκυψαν με χρήση εξανίου και εφαρμογή της μεθόδου εκχύλισης με υπέρηχους στις ίδιες συνθήκες ως προς την απόδοση ελαίου, το ασαπωνοποίητο υλικό (USM%) και τις επιμέρους στερόλες του πυρηνέλαιου. Οι βέλτιστες συνθήκες της εκχύλισης υποβοηθούμενης με υπέρηχους (UAE) συγκρίθηκαν με τη συμβατική εκχύλιση Soxhlet (SE) (συνθήκες εκχύλισης: S:L=1:8 g/mL, T≈78m°C, t=8 h, PS=1 mm, διαλύτης=εξάνιο και το μίγμα Η:Ι=3:2) όσον αφορά την απόδοση εκχύλισης σε πυρηνέλαιο, το USM%, τις επιμέρους κύριες στερόλες, το σκουαλένιο, το TPC και την αντιοξειδωτική δράση (DPPH) του ανακτώμενου πυρηνέλαιου. Βρέθηκε ότι το πυρηνέλαιο υπό τις βέλτιστες συνθήκες εκχύλισης με υπέρηχους εμφάνισε υψηλότερη απόδοση (κατά 11%) και καλύτερη ποιότητα όσον αφορά το ασαπωνοποίητο υλικό του (USM=4,51% ελαίου), το ολικό περιεχόμενο σε φαινολικά συστατικά (TPC=0,255 mg GA/g ελαίου) και την αντιοξειδωτική δράση του εκχυλιζόμενου πυρηνέλαιου (DPPH=0,225 mg Trolox/g έλαιο) από την αντίστοιχη του εκχυλιζόμενου πυρηνέλαιου με τη μέθοδο Soxhlet (SE) και διαλύτη εξάνιο (USM=3,68% ελαίου, TPC=0,207 mg GA/g ελαίου και DPPH=0,189 mg Trolox/g έλαιο, αντίστοιχα). Πρέπει να αναφερθεί ότι το εκχυλιζόμενο πυρηνέλαιο με υπέρηχους έφθασε περίπου το 82% της αντίστοιχης απόδοσης σε έλαιο και το 92% του συνολικού ασαπωνοποίητου υλικού αυτού (USM%), ενώ παρουσίασε περισσότερα φαινολικά συστατικά (TPC) (κατά 5,5%) και υψηλότερη αντιοξειδωτική δράση (DPPH) (κατά 8%) από εκείνο που ελήφθη με τη μέθοδο SE και διαλύτη το μίγμα Η:Ι=3:2. Όσον αφορά τις επιμέρους στερόλες και το σκουαλένιο, η συγκέντρωση της β-σιτοστερόλης που ελήφθη υπό τις βέλτιστες συνθήκες της UΑΕ ήταν 27 υψηλότερη (1,349 mg/g ελαίου) από εκείνη που λαμβάνεται με τη μέθοδο SE και χρήση εξανίου (0,911 mg/g ελαίου) ή του μίγματος H:I=3:2 (1,121 mg/g ελαίου). Το εκχυλιζόμενο έλαιο με τη μέθοδο SE και το μίγμα H:I=3:2 είχε αρκετά παρόμοια συγκέντρωση καμπεστερόλης (0,228 mg/g ελαίου) με την αντίστοιχη του ελαίου από εκχύλιση με υπέρηχους (0,208 mg/g ελαίου) και μικρότερη συγκέντρωση στιγμαστερόλης (0,101 mg/g ελαίου) σε σχέση με εκείνη που λαμβάνεται με εκχύλιση με υπέρηχους (0,115 mg/g ελαίου). Η συγκέντρωση του σκουαλένιου στα εκχυλιζόμενα έλαια βρέθηκε να μειώνεται κατά την ακόλουθη σειρά: SE-Η:I=3:2>UΑΕ-εξάνιο≈UΑΕ-Η:I=3:2>SE-εξάνιο. Περαιτέρω διερευνήθηκε η εκχύλιση φαινολικών συστατικών απευθείας από τον ελαιοπυρήνα. Εξετάστηκε η επίδραση του είδους του οργανικού διαλύτη και της συγκέντρωσής του σε νερό (% v/v) με συμβατική εκχύλιση στο ολικό περιεχόμενο φαινολικών συστατικών (TPC), στην αντιοξειδωτική δράση (DPPH) των εκχυλισμάτων και στα κυριότερα φαινολικά συστατικά των εκχυλισμάτων. Εξετάστηκαν οι οργανικοί διαλύτες, όπως η αιθανόλη, η μεθανόλη και η ακετόνη σε διαφορετικές αναλογίες σε νερό (50, 70 και 90 % v/v), και πραγματοποιήθηκε αριστοποίηση της συμβατικής εκχύλισης μέσω του σχεδιασμού Box-Behnken δύο επιπέδων (Τ=60 °C, S:L=1:12,5 g/mL, PS ξηρού ελαιοπυρήνα=1 mm, t=4 h). Από τα αποτελέσματα της μελέτης επιλέχθηκε η αιθανόλη σε αναλογία 70% v/v σε νερό ως ο διαλύτης εκχύλισης που παρέχει εκχυλίσματα με το υψηλότερο ολικό περιεχόμενο φαινολικών συστατικών (TPC=23,061 mg GA/g ελαιοπυρήνα ξ.β.), με τη μέγιστη αντιοξειδωτική δράση (DPPH=18,156 g ελαιοπυρήνα ξ.β./g DPPH), και με τη μέγιστη συγκέντρωση σε ελευρωπαΐνη (OL), υδροξυτυροσόλη (HY), ρουτίνη (RU) και στο σύνολο των προσδιοριζόμενων φαινολικών συστατικών των εκχυλισμάτων (SUM) (OL=0,834 mg/g ελαιοπυρήνα, HY=1,04 mg/g ελαιοπυρήνα, RU=0,493 mg/g ελαιοπυρήνα και SUM=2,41 mg/g ελαιοπυρήνα). Επιπλέον, διερευνήθηκε η επίδραση της χρήσης ενζύμων στην απόδοση των φαινολικών συστατικών από τον ελαιοπυρήνα. Τα ένζυμα που επιλέχθηκαν ήταν ένα μίγμα πηκτινάσης και πολυγαλακτουρονάσης με εμπορική ονομασία Novozym 33095, και αφού προσδιορίστηκε η βέλτιστη συγκέντρωση του ενζυμικού διαλύματος (1% v/v), μελετήθηκε η επίδραση της θερμοκρασίας (Τ=40 και 60 °C) και του χρόνου (t=1 και 4 h) στην υδατική εκχύλιση (CΕW), στην υδατική ενζυμική εκχύλιση (CEE) και στην εκχύλιση με χρήση αιθανόλης 70% (CEEth) του ελαιοπυρήνα για την ανάκτηση των φαινολικών του ενώσεων (S:L=1:12,5 g/mL, PS ξηρού ελαιοπυρήνα= 1 mm). Η υδατική εκχύλιση πραγματοποιήθηκε με χρήση ρυθμιστικού διαλύματος pH= 4,5. Η χρήση αιθανόλης 70% οδήγησε στην ανάκτηση εκχυλισμάτων με τη μέγιστη περιεκτικότητα σε φαινολικά συστατικά (TPC=23,88 mg GA/g ελαιοπυρήνα ξ.β.) και τη μέγιστη αντιοξειδωτική δράση (DPPH=18,36 g ελαιοπυρήνα ξ.β./g DPPH). Ωστόσο, εφαρμόζοντας την υδατική ενζυμική εκχύλιση στους 60 °C, ελήφθησαν εκχυλίσματα περισσότερο εμπλουτισμένα σε φαινολικά συστατικά και με μεγαλύτερη αντιοξειδωτική 28 δράση σε σύγκριση με τα αντίστοιχα της υδατικής εκχύλισης (TPC=11,41 mg GA/g ελαιοπυρήνα ξ.β. για την CEΕ και TPC=9,92 mg GA/g ελαιοπυρήνα ξ.β. για την CEW, αντίστοιχα). Η υψηλότερη συγκέντρωση της OL προέκυψε με αιθανόλη (OL=0,868 mg/g ελαιοπυρήνα), ακολουθούμενη από την υδατική ενζυμική εκχύλιση (OL=0,549 mg/g ελαιοπυρήνα) για 4 h στους 60 °C. Επίσης, η αιθανόλη 70% ήταν ο πιο αποτελεσματικός διαλύτης για την εκχύλιση της HY, ωστόσο η χρήση ενζύμων παρείχε εκχυλίσματα με συγκέντρωση σε HY που έφθασε το 88% της αντίστοιχης με χρήση αιθανόλης ως διαλύτη εκχύλισης. Επιπλέον, διερευνήθηκε η εφαρμογή των υπερήχων (UAE) για την εκχύλιση φαινολικών συστατικών από ελαιοπυρήνα. Εξετάστηκαν παράγοντες που επηρεάζουν την αποτελεσματικότητα της μεθόδου (είδος του διαλύτη=αιθανόλη, μεθανόλη και ακετόνη, συγκέντρωση=50, 70 και 90 % v/v, Τ=40, 60, 80 °C) και αριστοποιήθηκε η UAE ως προς το ολικό περιεχόμενο φαινολικών συστατικών (TPC), την αντιοξειδωτική δράση (DPPH) και τα κύρια φαινολικά συστατικά των εκχυλισμάτων του ελαιοπυρήνα (S:L=1:12,5 g/mL, PS ξηρού ελαιοπυρήνα=1 mm, t=30 min, συχνότητα υπερήχων: 60 kHz). Το μέγιστο TPC βρέθηκε 21,77 mg GA/g ελαιοπυρήνα με εφαρμογή T= 60 °C και διαλύτη αιθανόλη σε συγκέντρωση 70%. Η μέγιστη τιμή της αντιοξειδωτικής δράσης ήταν 20,95 g ελαιοπυρήνα ξ.β./g DPPH με Τ= 60 °C και διαλύτη αιθανόλη σε συγκέντρωση 70%. Η OL, η HY και το SUM εμφάνισαν τη μέγιστη τιμή συγκέντρωσης (OL=0,674 mg/g ελαιοπυρήνα, HY=1,161 mg/g ελαιοπυρήνα και SUM=2,32 mg/g ελαιοπυρήνα) στα εκχυλίσματα που προέκυψαν με εφαρμογή T= 60 °C και διαλύτη αιθανόλη σε συγκέντρωση 70%, ενώ η μέγιστη συγκέντρωση της RU βρέθηκε στα 0,421 mg/g ελαιοπυρήνα με εφαρμογή T= 70 °C και διαλύτη αιθανόλη σε συγκέντρωση 70%. Συγκρίνοντας τα αποτελέσματα με τα αντίστοιχα της συμβατικής μεθόδου, βρέθηκε ότι το TPC του εκχυλίσματος που ελήφθη υπό τις βέλτιστες συνθήκες με χρήση υπερήχων έφθασε το 93% του αντίστοιχου που ελήφθη με τη μέθοδο CE και ότι το εκχύλισμα από τους υπέρηχους εμφάνισε 13% μικρότερη αντιοξειδωτική δράση (DPPH) σε σχέση με εκείνο από τη CE. Το εκχύλισμα που ελήφθη υπό τις βέλτιστες συνθήκες εκχύλισης με υπέρηχους εμφάνισε υψηλότερη συγκέντρωση σε HY κατά 11% και το SUM ήταν παρόμοιο (κατά 98%) με το αντίστοιχο με τη συμβατική μέθοδο εκχύλισης (CE). Ωστόσο, πρέπει να σημειωθεί ότι το βέλτιστο αποτέλεσμα από την εκχύλιση με υπέρηχους ελήφθη σε μειωμένο χρόνο εκχύλισης (t=30 min), ενώ το αντίστοιχο αποτέλεσμα με τη μέθοδο CE ελήφθη για t=4 h. Η εκχύλιση υποβοηθούμενη με χρήση μικροκυμάτων (MAE) διερευνήθηκε ως μία ακόμη εναλλακτική μέθοδος εκχύλισης για την παραλαβή φαινολικών συστατικών από τον ελαιοπυρήνα και εξετάστηκε η επίδραση της θερμοκρασίας (T=40 και 60 °C) και του χρόνου (t=5 και 30 min) στην υδατική εκχύλιση (ΜΑΕW), στην υδατική ενζυμική εκχύλιση (ΜΑEE) και στην εκχύλιση με αιθανόλη 70% (ΜΑEEth) (S:L=1:12,5 g/mL, PS ξηρού ελαιοπυρήνα=1 29 mm, ισχύς μικροκυμάτων=200 W). Η χρήση αιθανόλης 70% και μικροκυμάτων (MAEEth) οδήγησε στην ανάκτηση εκχυλισμάτων με τη μέγιστη περιεκτικότητα σε TPC [⁓73% της αντίστοιχης περιεκτικότητας των εκχυλισμάτων σε TPC και ⁓5% λιγότερο δραστικά από αυτά με συμβατική μέθοδο (CEEth) εκχύλισης (στους 60 °C για 4 h), αντίστοιχα, τα οποία έχουν ληφθεί σε μικρότερο χρόνο (t=30 min)]. Ακόμη, αξίζει να σημειωθεί ότι εφαρμόζοντας την υδατική ενζυμική εκχύλιση με χρήση μικροκυμάτων (MAEE) στους 60 °C για 30 min, ελήφθησαν εκχυλίσματα κατά ⁓21% περισσότερο εμπλουτισμένα σε φαινολικά συστατικά και με καλύτερη αντιοξειδωτική δράση κατά ⁓9% σε σύγκριση με τα αντίστοιχα εκχυλίσματα που ελήφθησαν με την υδατική ενζυμική εκχύλιση με τη συμβατική μέθοδο (CEE) στους 60 °C για 4 h (TPC=14,37 mg GA/g ελαιοπυρήνα ξ.β. και DPPH=20,23 g ελαιοπυρήνα ξ.β./g DPPH για τη MAEΕ). Η αιθανόλη 70% με τη χρήση μικροκυμάτων (MAEEth) εκχύλισε αποτελεσματικά κατά ⁓83% περισσότερο την OL σε σύγκριση με τη συμβατική μέθοδο (CEEth). Η χρήση μικροκυμάτων και ενζύμου (MAEE) για 30 min στους 60 °C έδωσε εκχυλίσματα με παρόμοια συγκέντρωση OL (OL=0,549 mg/g ελαιοπυρήνα) σε σχέση με αυτά που προέκυψαν με χρήση ενζύμου και συμβατική εκχύλιση (CEE) στους 60 °C για 4h. Το SUM των εκχυλισμάτων με χρήση μικροκυμάτων εμφανίστηκε γενικότερα μεγαλύτερο και συγκεκριμένα για 30 min στους 60 °C ήταν κατά 64%, 27% και 28 % μεγαλύτερο με τη χρήση αιθανόλης 70% (SUM=7,040 mg/g ελαιοπυρήνα για MAEEth), υδατικής ενζυμικής (SUM=2,463 mg/g ελαιοπυρήνα για MAEE) και υδατικής εκχύλισης (SUM=1,975 mg/g ελαιοπυρήνα για MAEW) αντίστοιχα, σε σχέση με αυτό των αντίστοιχων εκχυλισμάτων που προέκυψαν με συμβατική μέθοδο εκχύλισης. Η εκχύλιση υποβοηθούμενη με χρήση ομογενοποιητή υψηλής ταχύτητας (ΗAE) αξιολογήθηκε ως μία καινοτόμος μέθοδος εκχύλισης για την ανάκτηση φαινολικών συστατικών από τον ελαιοπυρήνα και εξετάστηκε η επίδραση των παραμέτρων όπως της θερμοκρασίας (T=40 και 60 °C) και της ταχύτητας ανάδευσης (AS=4000 και 12000 rpm) στην υδατική εκχύλιση (HΑΕW), στην υδατική ενζυμική εκχύλιση (HΑEE) και στην εκχύλιση με αιθανόλη 70% (HΑEEth) (S:L=1:12,5 g/mL, PS ξηρού ελαιοπυρήνα=1 mm, t=30 min). Επιπλέον, εξετάστηκε η ενζυμική προκατεργασία του ελαιοπυρήνα (διάλυμα ενζύμου 1% v/v στους 40 °C για 1 h) πριν την εκχύλισή του με ομογενοποιητή υψηλής ταχύτητας. Η χρήση αιθανόλης 70% και ομογενοποιητή υψηλής ταχύτητας (HAEEth) οδήγησε στην ανάκτηση εκχυλισμάτων με τη μέγιστη περιεκτικότητα σε φαινολικά συστατικά (TPC=26,37 mg GA/g ελαιοπυρήνα ξ.β.), η οποία είναι κατά 12% μεγαλύτερη της αντίστοιχης περιεκτικότητας των εκχυλισμάτων με συμβατική μέθοδο εκχύλισης (CEEth) και τη μέγιστη αντιοξειδωτική δράση (DPPH=17,62 g ελαιοπυρήνα ξ.β./g DPPH), περίπου 5% πιο δραστικά από εκείνα που προέκυψαν με εφαρμογή της συμβατικής εκχύλισης (CEEth) στους 60 °C για 4 h και έχουν ληφθεί σε μικρότερο χρόνο (t=30 min). Εφαρμόζοντας την υδατική ενζυμική εκχύλιση με χρήση ομογενοποιητή υψηλής 30 ταχύτητας (HAEE) στους 60 °C στις 12000 rpm για 30 min, ελήφθησαν εκχυλίσματα κατά ⁓37% περισσότερο εμπλουτισμένα σε φαινολικά συστατικά (TPC=18,38 mg GA/g ελαιοπυρήνα ξ.β.) σε σύγκριση με τα αντίστοιχα εκχυλίσματα που ελήφθησαν με την υδατική ενζυμική εκχύλιση με τη συμβατική μέθοδο (CEE) στους 60 °C για 4 h και 20% περισσότερο σε σύγκριση με τα αντίστοιχα εκχυλίσματα που ελήφθησαν με την υδατική ενζυμική εκχύλιση με τη χρήση μικροκυμάτων (MAEE) στους 60 °C για 30 min. Συγκρίνοντας τα αποτελέσματα για την ενζυμική προκατεργασία του ελαιοπυρήνα προέκυψε ότι δεν διαφοροποιήθηκαν από εκείνα της υδατικής ενζυμικής εκχύλισης χωρίς προκατεργασία, άρα η δράση του μίγματος των ενζύμων είναι επαρκής κατά τη διάρκεια της ΗΑΕ. Η αιθανόλη 70% εκχύλισε με τη χρήση ομογενοποιητή ταχύτητας (HAEEth) αποτελεσματικά κατά ⁓86% περισσότερο την OL (OL=6,34 mg/g ελαιοπυρήνα) σε σύγκριση με τη συμβατική μέθοδο (CEEth). Η χρήση ομογενοποιητή υψηλής ταχύτητας και ενζύμου (HAEE) έδωσε εκχυλίσματα με παρόμοια συγκέντρωση ΗΥ σε σχέση με αυτά που προέκυψαν με χρήση αιθανόλης 70% (HAEEth) (HY=0,32 mg/g ελαιοπυρήνα). Η συγκέντρωση της RU στα αιθανολικά εκχυλίσματα βρέθηκε μεγαλύτερη (0,66 mg/g ελαιοπυρήνα) σε σύγκριση με την αντίστοιχη της υδατικής ενζυμικής εκχύλισης (RU=0,33 mg/g ελαιοπυρήνα). Το SUM των εκχυλισμάτων με τη χρήση αιθανόλης 70%, (HAEEth) εμφανίστηκε γενικότερα μεγαλύτερο και συγκεκριμένα για 30 min στους 60 °C και στις 12000 rpm ήταν κατά 67% μεγαλύτερο σε σχέση με εκείνο των αντίστοιχων εκχυλισμάτων που προέκυψαν με συμβατική μέθοδο εκχύλισης (CEEth). Γενικά, ο συνδυασμός της χρήσης ενζύμου και ομογενοποιητή υψηλής ταχύτητας (HAEE) συνέβαλε σε εκχυλίσματα με πιο εμπλουτισμένα φαινολικά προφίλ και μεγαλύτερες συγκεντρώσεις σε επιμέρους φαινολικές ενώσεις σε σύγκριση με τη συμβατική εκχύλιση (CEW και CEE)και την εκχύλιση με μικροκύματα (MAEW και MAEE). Στα πλαίσια της διερεύνησης καινοτόμων μεθόδων εκχύλισης, μελετήθηκε η εφαρμογή της τεχνολογίας της υπερυψηλής υδροστατικής πίεσης (HHPAE) για την ανάκτηση φαινολικών συστατικών από τον ελαιοπυρήνα και εξετάστηκε η επίδραση της πίεσης (P=300 και 600 MPa) και του χρόνου (t=5 και 10 min) στην υδατική εκχύλιση (HHPΑΕW), στην υδατική ενζυμική εκχύλιση (HHPΑEE) και στην εκχύλιση με αιθανόλη 70% (HHPΑEEth) (S:L=1:12,5 g/mL, PS ξηρού ελαιοπυρήνα= 1 mm, T=25 °C). Η χρήση αιθανόλης 70% (HHPAEEth) και η υδατική ενζυμική εκχύλιση (HHPAEE) σε συνδυασμό με την υψηλή υδροστατική πίεση οδήγησε στην ανάκτηση εκχυλισμάτων με τη μέγιστη περιεκτικότητα σε φαινολικά συστατικά. Τα αιθανολικά εκχυλίσματα (TPC=16,52 mg GA/g ελαιοπυρήνα ξ.β.) αποτελούν το ⁓71% της αντίστοιχης περιεκτικότητας των εκχυλισμάτων με συμβατική μέθοδο εκχύλισης(CEEth) και έχουν ληφθεί σε μικρότερο χρόνο (t=10 min). Ακόμη, εφαρμόζοντας την υδατική ενζυμική εκχύλιση με χρήση υπερυψηλής υδροστατικής πίεσης (HHPAEE) στα 600 ΜPa για 10 min, ελήφθησαν εκχυλίσματα κατά ⁓23% περισσότερο εμπλουτισμένα σε φαινολικά συστατικά 31 (TPC=14,84 mg GA/g ελαιοπυρήνα ξ.β.) σε σύγκριση με τα αντίστοιχα εκχυλίσματα που ελήφθησαν με την υδατική ενζυμική εκχύλιση και τη συμβατική μέθοδο (CEE) στους 60 °C για 4 h και 36% περισσότερο, σε σύγκριση με τα αντίστοιχα εκχυλίσματα που ελήφθησαν με την υδατική εκχύλιση και τη χρήση υπερυψηλής υδροστατικής πίεσης (HHPAEW) στα 600 ΜPa για 10 min (TPC=9,25 mg GA/g ελαιοπυρήνα ξ.β.). Τα εκχυλίσματα με μέγιστη τιμή αντιοξειδωτικής δράσης ελήφθησαν με εφαρμογή ΗHPAEE στα 600 ΜPa για 10 min (DPPH=20,32 g ελαιοπυρήνα ξ.β./g DPPH) και ήταν περίπου κατά 90% το ίδιο δραστικά με εκείνα που προέκυψαν από την εφαρμογή της συμβατικής εκχύλισης με ένζυμα (CEE) στους 60 °C για 4 h, καθώς και κατά 73% και 32%, αντίστοιχα πιο δραστικά σε σύγκριση εκείνα που προέκυψαν με την υδατική εκχύλιση και την εκχύλιση με αιθανόλη 70% (DPPH=35,21 g ελαιοπυρήνα ξ.β./g DPPH για την ΗHPAEW και DPPH=26,85 g ελαιοπυρήνα ξ.β./g DPPH για την ΗHPAEEth, αντίστοιχα). Η αιθανόλη 70% εκχύλισε με τη χρήση υπερυψηλής υδροστατικής πίεσης αποτελεσματικά κατά ⁓84% περισσότερο την OL (OL=4,42 mg/g ελαιοπυρήνα) σε σύγκριση με τη συμβατική μέθοδο (CEEth). Η χρήση υπερυψηλής υδροστατικής πίεσης και ενζύμου (HHPAEE) έδωσε εκχυλίσματα με παρόμοια συγκέντρωση ΗΥ (HY=0,38 mg/g ελαιοπυρήνα) και RU (RU=0,22 mg/g ελαιοπυρήνα) σε σχέση με εκείνα που προέκυψαν με χρήση αιθανόλης 70% (HHPAEEth). Το SUM των εκχυλισμάτων με τη χρήση αιθανόλης 70%, εμφανίστηκε γενικότερα μεγαλύτερο και συγκεκριμένα στα 600 ΜPa για 10 min (SUM=5,13 mg/g ελαιοπυρήνα) ήταν κατά 52% μεγαλύτερο σε σχέση με αυτό των αντίστοιχων εκχυλισμάτων που προέκυψαν με συμβατική μέθοδο εκχύλισης (CEEth) (στους 60 °C για 4 h). Στα πλαίσια της διερεύνησης νέων «φιλικών προς το περιβάλλον» πράσινων διαλυτών, μελετήθηκε η εφαρμογή νέων πράσινων ευτηκτικών διαλυτών (NADES) σε συνδυασμό με τις εναλλακτικές καινοτόμες μεθόδους εκχύλισης, όπως χρήση ομογενοποιητή υψηλής ταχύτητας (ΗΑΕ), μικροκυμάτων (ΜΑΕ), υπερήχων (UAE) και υπερυψηλής υδροστατικής πίεσης (HHPAE) για την ανάκτηση φαινολικών συστατικών από τον ελαιοπυρήνα. Χρησιμοποιήθηκαν τέσσερα διαφορετικά συστήματα ευτηκτικών διαλυτών (NADES) που αποτελούνται από μίγμα χλωριούχου χολίνης με μαλτόζη (DES-MA), γλυκερόλη (DES-GLY), κιτρικό οξύ (DES-CA) και γαλακτικό οξύ (DES-LA) και εφαρμόστηκαν διαφορετικές λειτουργικές παράμετροι, ανάλογα με τη μέθοδο εκχύλισης (S:L= 1:12,5 g/mL, PS ξηρού ελαιοπυρήνα= 1 mm, t= 30 min). Ο διαλύτης DES-CA έδειξε την καλύτερη απόδοση εκχύλισης όσον αφορά το TPC και την αντιοξειδωτική δράση (DPPH) των εκχυλισμάτων που λαμβάνονται από την ΗΑΕ (TPC=34,08 mg GA/g ελαιοπυρήνα ξ.β., DPPH=5,11 g ελαιοπυρήνα ξ.β./g DPPH) και την UΑΕ (TPC=20,14 mg GA/g ελαιοπυρήνα ξ.β., DPPH=20,69 g ελαιοπυρήνα ξ.β./g DPPH) και ο DES-LA για την ΜΑΕ (TPC=29,57 mg GA/g ελαιοπυρήνα ξ.β., DPPH=17,51 g ελαιοπυρήνα ξ.β./g DPPH) και την ΗΗΡΑΕ (TPC=25,96 mg 32 GA/g ελαιοπυρήνα ξ.β., DPPH=15,67 g ελαιοπυρήνα ξ.β./g DPPH), αντίστοιχα. Η HAE αποδείχθηκε ότι είναι η πιο αποτελεσματική μέθοδος δίνοντας εκχυλίσματα με τις μέγιστες αποδόσεις, τις ισχυρότερες αντιοξειδωτικές δράσεις και τις υψηλότερες συγκεντρώσεις σε OL (OL=12,86 mg/g ελαιοπυρήνα), RU (RU=1,71 mg/g ελαιοπυρήνα) καθώς και στο SUM (SUM=18,30 mg/g ελαιοπυρήνα) σε σύγκριση με τις MAE, UAE και HHPAE. Η ανάλυση των εκχυλισμάτων με HPLC έδειξε ότι σχεδόν όλα τα εκχυλίσματα με ευτηκτικούς διαλύτες (NADES) σε όλες τις μεθόδους που εξετάστηκαν ήταν περισσότερο εμπλουτισμένα σε φαινολικές ενώσεις από εκείνα με τους συμβατικούς διαλύτες [αιθανόλη 70%, νερό (ρυθμιστικό διάλυμα pH=4,5)]. Στα πλαίσια της αξιολόγησης της αντιοξειδωτικής δραστικότητας των εκχυλισμάτων των φαινολικών συστατικών από τον ελαιοπυρήνα εξετάστηκαν εφαρμογές σε συστήματα τροφίμων. Συγκεκριμένα, μελετήθηκε η αντιοξειδωτική δράση αιθανολικού εκχυλίσματος ελαιοπυρήνα και των κλασμάτων του (κλάσμα εξανίου, χλωροφορμίου, οξικού αιθυλεστέρα, και νερού) σε πρότυπο ακόρεστο λιπαρό οξύ όπως το λινελαϊκό οξύ και σε φυτικό έλαιο όπως το ηλιέλαιο (σε συγκέντρωση 200 ppm). Το αιθανολικό εκχύλισμα και το κλάσμα του οξικού αιθυλεστέρα είχαν ισχυρότερη αντιοξειδωτική δράση (2,32 g εκχυλίσματος/g DPPH για το αιθανολικό εκχύλισμα και 1,20 g εκχυλίσματος/g DPPH για το κλάσμα οξικού αιθυλεστέρα) από ότι τα κλάσματα του εξανίου (247,2 g εκχυλίσματος/g DPPH), του χλωροφορμίου (5,41 g εκχυλίσματος/g DPPH) και του νερού (3,71 g εκχυλίσματος/g DPPH) έναντι της οξείδωσης του λινελαϊκού οξέος (στους 40 °C για 140 h). Επιπλέον, η υψηλότερη αντιοξειδωτική δραστικότητα στη θερμική οξείδωση του ηλιέλαιου παρατηρήθηκε με το κλάσμα του οξικού αιθυλεστέρα που είχε την υψηλότερη συγκέντρωση σε ολικά φαινολικά συστατικά (TPC=108,41 mg GA/g εκχυλίσματος). Η αντιοξειδωτική δράση του αιθανολικού εκχυλίσματος του ελαιοπυρήνα και των κλασμάτων του έναντι της θερμικής οξείδωσης (για 60 h στους 80 °C ) ηλιέλαιου με βάση τον αριθμό υπεροξειδίων του ελαίου ήταν κατά σειρά: ΒΗΤ >κλάσμα οξικού αιθυλεστέρα >αιθανολικό εκχύλισμα >κλάσμα χλωροφορμίου >κλάσμα νερού >κλάσμα εξανίου >α-τοκοφερόλης >δείγμα αναφοράς. Ακόμη, εφαρμόστηκε η ενσωμάτωσή των φαινολικών συστατικών του ελαιοπυρήνα ως έχουν ή και προστατευμένα σε εγκλεισμένη μορφή σε γαλακτώματα με βάση το ελαιόλαδο (εμπλουτισμένο ελαιόλαδο) και διερευνήθηκε η αντιοξειδωτική δραστικότητα και η οξειδωτική σταθερότητά τους στα εμπλουτισμένα ελαιόλαδα. Τα εμπλουτισμένα ελαιόλαδα (με προσθήκη φαινολικών συστατικών TPC≈0,115 mg GA/g ελαίου) μελετήθηκαν ως προς τη σταθερότητά τους σε επιταχυνόμενες συνθήκες οξείδωσης (αποθήκευση στους 80 °C). Ο αριθμός υπεροξειδίων, ο αριθμός ανισιδίνης και οι συντελεστές απορρόφησης K232 και K270 όλων των εμπλουτισμένων ελαίων ήταν σημαντικά χαμηλότεροι από τους αντίστοιχους του αρχικού ελαιόλαδου κατά τη διάρκεια των 15 ημερών αποθήκευσης, υποδεικνύοντας ότι και ο 33 ελαιοπυρήνας αποτελεί σημαντική πηγή φαινολικών συστατικών που είναι ικανά να βελτιώσουν την οξειδωτική σταθερότητα των ελαίων. Επιπλέον, τα αποτελέσματα της μεταβολής της οξειδωτικής σταθερότητας του αρχικού ελαιόλαδου και των εμπλουτισμένων ελαιόλαδων υπό επιταχυνόμενες συνθήκες με την ταχεία μέθοδο Oxitest® έδειξαν ότι το αρχικό ελαιόλαδο οξειδώθηκε πιο γρήγορα [περίοδος επαγωγής (ΙΡ)=22,13h], ενώ οι φαινολικές ενώσεις από τον ελαιοπυρήνα επέτυχαν να παρατείνουν την οξειδωτική σταθερότητα των εμπλουτισμένων ελαίων, παρουσιάζοντας υψηλότερες τιμές IP (IP=23,59 h-27,99 h) σε σύγκριση με το αρχικό ελαιόλαδο. Ως εκ τούτου, τα εξεταζόμενα εκχυλίσματα θα μπορούσαν να χρησιμοποιηθούν ως φυσικά πρόσθετα στη βιομηχανία τροφίμων, δεδομένου ότι ενισχύουν την οξειδωτική σταθερότητα των τελικών προϊόντων. Από τη μελέτη επομένως διαφαίνεται ότι υπάρχουν ενδιαφέρουσες εναλλακτικές προοπτικές στη συμβατική εκχύλιση για την παραλαβή τόσο πυρηνέλαιου ενισχυμένου ποιοτικά σε βιοδραστικά συστατικά (στερόλες και σκουαλένιο) όσο και για την παραλαβή φαινολικών συστατικών απευθείας από τον ελαιοπυρήνα με βελτιωμένες ιδιότητες, που μπορούν να ενσωματωθούν σε συστήματα τροφίμων, οδηγώντας έτσι στην παραγωγή νέων/καινοτόμων προϊόντων υψηλών προδιαγραφών.