Ενζυμική επεξεργασία τυρογάλακτος για παραγωγή προϊόντων προστιθέμενης αξίας

Ζαφείρη, Ειρήνη; Zafeiri, Eirini

dc.contributor.author	Ζαφείρη, Ειρήνη	el
dc.contributor.author	Zafeiri, Eirini	en
dc.date.accessioned	2020-11-23T21:12:03Z
dc.date.available	2020-11-23T21:12:03Z
dc.identifier.uri	https://dspace.lib.ntua.gr/xmlui/handle/123456789/52018
dc.identifier.uri	http://dx.doi.org/10.26240/heal.ntua.19716
dc.rights	Default License
dc.subject	Τυρόγαλα	el
dc.subject	Γλυκός ορός	el
dc.subject	Προβιοτικά	el
dc.subject	Γαλακτοολιγοσακχαρίτες	el
dc.subject	β-γαλακτοζιδάση	el
dc.subject	Αντίδραση τρανσγαλακτοζυλίωσης	el
dc.subject	Sweet whey	en
dc.subject	Galactooligosaccharides (GOS)	en
dc.subject	Αξιοποίηση λακτόζης	el
dc.subject	Enzymatic conversion of lactose	en
dc.subject	Probiotics	en
dc.subject	β-galactosidase	en
dc.subject	Kluyveromyces lactis	en
dc.subject	HPLC-RI	en
dc.subject	HPAEC-PAD	en
dc.subject	Υδρόλυση λακτόζης	el
dc.subject	Hydrolysis	en
dc.subject	Transglycosylation	en
dc.title	Ενζυμική επεξεργασία τυρογάλακτος για παραγωγή προϊόντων προστιθέμενης αξίας	el
dc.title	Enzymatic valoritation of sweet whey from cheese manufacturing	en
heal.type	bachelorThesis
heal.classification	Τρόφιμα	el
heal.classification	Μηχανική τροφίμων	el
heal.classification	Food industry	en
heal.classification	Food engineering	en
heal.language	el
heal.access	free
heal.recordProvider	ntua	el
heal.publicationDate	2020-02-21
heal.abstract	Στόχος της παρούσας διπλωματικής εργασίας είναι η αξιοποίηση του τυρογάλακτος για την παραγωγή γαλακτοολιγοσακχαριτών (Galactooligosaccharides, GOS). Η σύνθεση των GOS επιτυγχάνεται αξιοποιώντας την περιεχόμενη λακτόζη στο τυρόγαλα μέσω μιας ενζυμικής αντίδρασης. Η ενζυμική αντίδραση πραγματοποιείται με χρήση του ενζύμου β-γαλακτοζιδάση από τον μικροοργανισμό Kluyveromyces lactis ως βιοκαταλύτη. Σε πρώτο στάδιο έγινε ένας πλήρης χημικός χαρακτηρισμός του τυρογάλακτος αναλύοντας τα διάφορα συστατικά του. Βρέθηκε ότι ο γλυκός ορός περιέχει 5,63% w/v (±0,08) ολικά σάκχαρα εκ των οποίων η λακτόζη αποτελεί το 5,08% w/v (±0,08). Οι περιεχόμενες πρωτεΐνες προσδιορίστηκαν με τη μέθοδο Kjeldhal, όπου το ποσοστό τους βρέθηκε ίσο με 2,93% w/w (±0,56). Τα ολικά στερεά και η τέφρα βρέθηκαν ίσα με 4,90% w/w (±0,08) και 0,46% w/w (±0,01), αντίστοιχα. Η αλατότητα του τυρογάλακτος προσδιορίστηκε με τη μέθοδο Mohr και προέκυψε ίση με 0,248% w/v (±0,015). Κατά την χημική ανάλυση του γλυκού ορού μετρήθηκαν τα θειικά ιόντα και το γαλακτικό οξύ με τη μέθοδο της νεφελομετρίας και φασματοφωτομετρίας, αντίστοιχα. Προέκυψε ότι περιέχονται 95,6mg/L (±0,01) SO42- και 1,65 g/L (±0,06) γαλακτικό οξύ. Τέλος, προσδιορίστηκαν τα κύρια μέταλλα που υπάρχουν στο τυρόγαλα με τη μέθοδο της Φασματομετρίας Ατομικής Εκπομπής με Ιοντικά Συζευγμένο Πλάσμα (ICP-AES). Τα αποτελέσματα του ICP-AES έδειξαν ότι στο τυρόγαλα περιέχονται 31,4 mM (±1,5) K+, 16,7 mM (± 1,1) Na+, 8,60 mM (±0,32) Ca2+ και 1,14 mM (±0,08) Mg2+. Σε επόμενο στάδιο κρίθηκε απαραίτητο να μελετηθεί το κατά πόσο το τυρόγαλα αποτελεί κατάλληλο υπόστρωμα για την ενζυμική αντίδραση. Πρωταρχικά πειράματα έδειξαν ότι κατά την επώαση του τυρογάλακτος σε θερμοκρασία 40 °C, η τιμή pH του τυρογάλακτος μειωνόταν ραγδαία, γεγονός που οφειλόταν στην ύπαρξη υψηλού αρχικού μικροβιακού φορτίου. Η μείωση της τιμής pH του υποστρώματος αποτέλεσε σημαντικό παρεμποδιστικό παράγοντα για την εξέλιξη της ενζυμικής αντίδρασης, αφού το ένζυμο της β-γαλακτοζιδάσης από τον μικροοργανισμό K. Lactis δρα βέλτιστα στο εύρος τιμών pH από 6,8 έως 7,2. Συνεπώς, η μείωση της τιμής pH χαμηλότερα του 6,5 οδηγεί σε σταδιακή μείωση της ενεργότητας του ενζύμου και τελικά την πλήρη απενεργοποίηση του. Για την αντιμετώπιση του μικροβιακού φορτίου του τυρογάλακτος δοκιμάστηκε η μέθοδος της υπερδιήθησης με χρήση μεμβράνης με ονομαστικό πορώδες 0,22 μm. Με τη μέθοδο αυτή επιτεύχθηκε απομάκρυνση του αρχικού μικροβιακού φορτίου σε επίπεδα τέτοια ώστε, κατά την μετέπειτα επώαση του τυρογάλακτος σε θερμοκρασία 40 °C, η πτώση της τιμής του pH να είναι μικρή και εντός των ορίων της βέλτιστης δράσης του ενζύμου (6,8-7,2). Τελικά, επιλέχθηκε το τυρόγαλα να επεξεργάζεται αρχικά με υπερδιήθηση και κατόπιν να παστεριώνεται στους 85 °C για 5 min, με στόχο την απενεργοποίηση του τυχόν υπολειμματικού μικροβιακού φορτίου, πριν χρησιμοποιηθεί ως υπόστρωμα για την ενζυμική αντίδραση. Στη συνέχεια μελετήθηκε η επίδραση διαφόρων παραμέτρων, όπως η αρχική συγκέντρωση σε λακτόζη του τυρογάλακτος, η θερμοκρασία και το ενζυμικό φορτίο, στην αντίδραση της ενζυμικής μετατροπής της λακτόζης του τυρογάλακτος σε GOS. Για το σκοπό αυτό, μελετήθηκε η ενζυμική ενεργότητα της β-γαλακτοζιδάσης από τον K. lactis στο θερμοκρασιακό εύρος 30-50 °C και εύρος τιμών pH 6,0-8,0. Το ένζυμο β-γαλακτοζιδάση από τον K. lactis εμφάνισε βέλτιστη δράση σε τιμή pH ίση με 7,0 και σε θερμοκρασία ίση με 30 °C. Στις συνθήκες αυτές, η ενεργότητα του χρησιμοποιούμενου ενζύμου, όπως αυτή προσδιορίστηκε με τη μέθοδο της ορθο-νιτροφαινυλο-β-D-γαλακτοπυρανόζη (oNPG), βρέθηκε ίση με 22,4 (±0,1) U/mL. Συνολικά, πραγματοποιήθηκαν 18 ενζυμικές αντιδράσεις χρησιμοποιώντας ως υπόστρωμα το τυρόγαλα. Μελετήθηκε τυρόγαλα αρχικής περιεκτικότητας σε λακτόζη 5, 10 και 15% w/v, ενζυμικό φορτίο 0,011, 0,022 και 0,045 U/mL, καθώς και θερμοκρασία ενζυμικής αντίδρασης 30 και 40 °C, ενώ η τιμή pH του υποστρώματος σε όλες τις αντιδράσεις ήταν ρυθμισμένη στην τιμή 7,2. Η ανάλυση των δειγμάτων της ενζυμικής αντίδρασης πραγματοποιήθηκε με Υγρή Χρωματογραφία Υψηλής Απόδοσης με ανιχνευτή Δείκτη Διάθλασης (High Performance Liquid Chromatography-Refraction Index, HPLC-RI) και η ποσοτικοποίηση των αποτελεσμάτων πραγματοποιήθηκε με χρήση καμπυλών αναφοράς γαλακτόζης, λακτόζης και ραφινόζης. Από τα αποτελέσματα φάνηκε ότι, αύξηση της αρχικής συγκέντρωσης της λακτόζης στο υπόστρωμα οδηγεί σε παραγωγή μεγαλύτερης ποσότητας γαλακτοολιγοσακχαριτών, καθώς και αύξηση του ενζυμικού φορτίου οδηγεί σε μέγιστη παραγωγή GOS σε μικρότερους χρόνους ενζυμικής αντίδρασης. Αναφορικά με την επίδραση της θερμοκρασίας, στους 40 °C παρατηρήθηκαν υψηλότερες αποδόσεις σε GOS και σε μικρότερους χρόνους ενζυμικής αντίδρασης σε σχέση με τους 30 °C. Ως προς το χαρακτηρισμό των προϊόντων της ενζυμικής αντίδρασης, παρατηρήθηκε ότι παράγονται γαλακτοολιγοσακχαρίτες με βαθμό πολυμερισμού έως και 4. Χαρακτηριστικό για όλες τις μελετώμενες ενζυμικές αντιδράσεις αποτέλεσε το ότι μετά την επίτευξη του μέγιστου ποσοστού παραγόμενων GOS, παρατηρήθηκε μείωση της συγκέντρωσης των GOS στο μείγμα της αντίδρασης. Όπως αναφέρεται και βιβλιογραφικά, αυτό οφείλεται στην περαιτέρω υδρόλυση των σχηματισμένων GOS από το ένζυμο της β-γαλακτοζιδάσης. Για κάθε συγκέντρωση λακτόζης στο αντιδρών μείγμα επιτεύχθηκαν οι εξής μέγιστες αποδόσεις σε GOS: α) 10,4% μετά από 90 min ενζυμικής αντίδρασης με χρήση ενζυμικού φορτίου 0,045 U/mL στους 30 °C και αρχική συγκέντρωση λακτόζης 5% w/v, β) 9,64% μετά από 120 min ενζυμικής αντίδρασης με χρήση ενζυμικού φορτίου 0,022 U/mL στους 40 °C και αρχική συγκέντρωση λακτόζης 5% w/v, γ) 13,6% μετά από 420 min ενζυμικής αντίδρασης με χρήση ενζυμικού φορτίου 0,011 U/mL στους 30 °C και αρχική συγκέντρωση λακτόζης 10% w/v, δ) 16,5% μετά από 480 min ενζυμικής αντίδρασης με χρήση ενζυμικού φορτίου 0,011 U/mL στους 40 °C και αρχική συγκέντρωση λακτόζης 10% w/v, ε) 18,4% μετά από 420 min ενζυμικής αντίδρασης με χρήση ενζυμικού φορτίου 0,045 U/mL στους 30 °C και αρχική συγκέντρωση λακτόζης 15% w/v, στ) 21,7% μετά από 300 min ενζυμικής αντίδρασης με χρήση ενζυμικού φορτίου 0,045 U/mL στους 40 °C και αρχική συγκέντρωση λακτόζης 15% w/v. Συμπερασματικά, η παραγωγή γαλακτοολιγοσακχαριτών, συστατικά υψηλής προστιθέμενης αξίας, από το τυρόγαλα μπορεί να αποτελέσει μια βιώσιμη εναλλακτική μέθοδο αξιοποίησης του, συμβατής με τις αρχές της κυκλικής οικονομίας. Συνδυάζει το κόστος διαχείρισης ενός σημαντικού αποβλήτου και την αντιμετώπιση ενός περιβαλλοντικού προβλήματος, μετατρέποντάς το σε μια πολύτιμη πρώτη ύλη. Η αριστοποίηση της διεργασίας καθώς και η μελέτη της σύνθεσης GOS με χρήση ενζύμου β-γαλακτοζιδάσης από κάποιον άλλο μικροοργανισμό, όπως ο Aspergillus oryzae, εμφανίζουν ενδιαφέρον για μελλοντική έρευνα. Ακόμη, η απομόνωση και αξιοποίηση των πρωτεϊνών που περιέχονται στο γλυκό ορό, με στόχο της παραγωγή ενός πρωτεϊνούχου συμπυκνώματος σε συνδυασμό με τους γαλακτοολιγοσακχαρίτες, μπορεί να είναι ένας μελλοντικός στόχος για την παρασκευή ενός συμπληρώματος με υψηλή θρεπτική και πρεβιοτική αξία.	el
heal.abstract	The purpose of this diploma thesis was the study of the utilization of sweet whey, via the enzymatic conversion of the containing lactose into galactooligosaccharides (GOS). The enzymatic reaction was carried out using the enzyme β-galactosidase, derived from the microorganism Kluyveromyces lactis, as a biocatalyst. Initially, a complete chemical characterization of the sweet whey was performed by analyzing its various constituents. It was found that the sweet whey comprises 5.63% w/v (±0.08) total sugars, of which lactose accounts for 5.08% w/v (±0.08). The protein content was determined by the Kjeldhal method and was found equal to 2.93% w/w (±0.56). The total solids and ash were found to be equal to 4.90% w/w (±0.08) and 0.46% w/w (±0.01), respectively. The salinity of sweet whey, as determined by the Mohr method, was 0.248% w/v (±0.015). The sulphates and lactic acid content of sweet whey, as they were determined by the method of nephelometry and spectrophotometry, respectively, were found to be equal to 95.6 mg/L (±0.01) SO42- and 1.65 g/L (±0.06) lactic acid. Finally, the major metals of sweet whey were determined by Inductively Coupled Plasma – Atomic Emission Spectrometry (ICP-AES) method, and results showed that sweet whey contains 31.4 mM (±1.5) K+, 16.7 mM (±1.1) Na+, 8.60 mM (±0.32) Ca2+, and 1.14 mM (±0.08) Mg2+. In the second part of this study, different treatments of sweet whey were studied in order to ensure that the whey can be effectively used in the above mentioned enzymatic reaction as to produce GOS. Preliminary experiments showed that during the incubation of sweet whey at 40 °C, a great reduction of its pH value was observed, indicating the presence of a high initial microbial load. This could lead to major problems during the studied enzymatic reaction, since the enzyme β-galactosidase from K. lactis exhibits optimum activity in the pH range of 6.8 to 7.2. Therefore, a pH decrease below 6.5 could result in a gradual decrease in β-galactosidase activity and eventually to the complete inactivation of the enzyme. The method of ultrafiltration, using a membrane with a nominal porosity of 0.22 µm, was tested to treat the antimicrobial load of whey. This method resulted in the removal of the initial microbial load to levels such that, upon subsequent incubation of the whey at 40 ° C, the drop in pH was small and within the range of optimal enzyme activity (6.8- 7.2). Finally, the whey was selected to be first treated by ultrafiltration and then pasteurized at 85 ° C for 5 min, with the aim of inactivating any residual microbial load, before being used as a substrate for the enzyme reaction. The effect of various parameters was then studied on the enzyme conversion of lactose into GOS, such as initial lactose concentration of sweet whey, reaction temperature and enzymatic load. To this end, the enzyme activity of β-galactosidase from K. lactis was evaluated in the temperature range of 30-50 °C and pH range of 6.0-8.0. The enzyme showed an optimum activity at the pH value of 7.0 and at 30 °C, with the enzyme activity being equal to 22.4 (±0.06) U/mL, as it was determined by the method of ortho-nitrophenyl-β-D-galactopyranose (oNPG). In total, 18 enzyme reactions were performed using sweet whey as a substrate. Initial whey lactose content of 5, 10 and 15% w/v, enzymatic load of 0.011, 0.022 and 0.045 U/mL, and enzyme reaction temperatures of 30 and 40 °C were tested, while the pH value of the substrate was adjusted to 7.2. The analysis of the results of the enzymatic reactions was performed with High Performance Liquid Chromatography-Refraction Index detector (HPLC-RI), and the formed GOS were quantified using reference curves of galactose, lactose and raffinose. It was observed that an increase in lactose concentration resulted in higher amount of the formed GOS, and an increase in enzymatic load led to higher GOS production at shorter reaction times. Regarding the effect of temperature, higher GOS yields and at shorter reaction times were observed at 40 °C than at 30 °C. As for the characterization of the reaction products, it was observed that the formed galactooligosaccharides had polymerization degree up to 4. It is worth noticing that, in all enzymatic reactions studied, after achieving the maximum GOS yield, a decrease in GOS concentration was observed. As previously reported by many researchers, this is due to a further hydrolysis of the formed GOS by the enzyme. For each initial lactose concentration in the reaction system, the following maximum GOS yields were obtained: (a) 10.4% after 90 min of enzymatic reaction using an enzymatic load of 0.045 U/mL at 30 °C and initial lactose concentration of 5% w/v, (b) 9.64% after 120 min of enzymatic reaction using an enzyme load of 0.022 U/mL at 40 °C and initial lactose concentration of 5% w/v, (c) 13.6% after 420 min of enzymatic reaction using an enzyme load of 0.011 U/mL at 30 °C and initial lactose concentration of 10% w/v, (d) 16.5% after 480 min of enzymatic reaction using an enzymatic load of 0.011 U/mL at 40 °C and initial lactose concentration of 10% w/v, (e) 18.4% after 420 min of enzymatic reaction using an enzymatic load of 0.045 U/mL at 30 °C and initial lactose concentration of 15% w/v, (f) 21.7% after 300 min of enzymatic reaction using an enzymatic load of 0.045 U/mL at 40 °C and initial lactose concentration of 15% w/v. In conclusion, the galactooligosaccharides, which are ingredients of high demand by consumers, could be possibly produced by the enzymatic conversion of sweet whey lactose. This procedure combines the managing cost of a significant waste, turning an environmental problem into a valuable raw material with high nutritional value. The optimization of the process as well as the study of GOS synthesis using a β-galactosidase derived from another microorganism, such as Aspergillus oryzae, which exhibits optimum pH value from 4.5 to 4.8 looks promising for future research. In addition, the isolation and utilization of proteins contained in the sweet whey in order to produce a protein concentrate, in combination with GOS, may be a future target for the production of a protein supplement of high nutritional and prebiotic value.	en
heal.advisorName	Ταούκης, Πέτρος	el
heal.advisorName	Taoukis, Petros	en
heal.committeeMemberName	Τόπακας, Ευάγγελος	el
heal.committeeMemberName	Topakas, Evangelos	en
heal.committeeMemberName	Sarimveis, Haralambos	en
heal.committeeMemberName	Σαρίμβεης, Χαράλαμπος	el
heal.academicPublisher	Εθνικό Μετσόβιο Πολυτεχνείο. Σχολή Χημικών Μηχανικών. Τομέας Σύνθεσης και Ανάπτυξης Βιομηχανικών Διαδικασιών (IV). Εργαστήριο Χημείας και Τεχνολογίας Τροφίμων	el
heal.academicPublisherID	ntua
heal.numberOfPages	129 σ.	el
heal.fullTextAvailability	false