Μικροβιακή παραγωγή δευτερογενών μεταβολιτών με σκοπό τη βιοτεχνολογική τους αξιολόγηση σαν φυσικά φάρμακα

Abstract

Στα πλαίσια της παρούσας διδακτορικής διατριβής, μελετήθηκαν σε συνθήκες υγρής βυθισμένης καλλιέργειας (ΥΒΚ) δύο είδη μακρομυκήτων με σκοπό τη βιοτεχνολογική τους αξιοποίηση ως φυσική πηγή βιολειτουργικών διατροφικών συστατικών. Συγκεκριμένα, διερευνήθηκε το εδώδιμο Pleurotus ostreatus, καθώς και το Ganoderma australe, το γένος του οποίου θεωρείται από τα σημαντικότερα ως προς την παραγωγή φαρμακευτικών ενώσεων. Τα στελέχη των παραπάνω μακρομυκήτων που μελετήθηκαν για πρώτη φορά, συλλέχτηκαν από τον Ελλαδικό χώρο και βρίσκονται κατατεθειμένα στη Συλλογή Καλλιεργειών ATHUM του Πανεπιστημίου Αθηνών (ATHUM 4438 και ATHUM 4345, αντίστοιχα). Ο αρχικός στόχος της μελέτης προσανατολίστηκε στον προσδιορισμό του καταλληλότερου μέσου ανάπτυξης για μέγιστη παραγωγής βιομάζας από τα δύο στελέχη μακρομυκήτων. Σε αυτήν την κατεύθυνση, η επιλεκτική αφομοίωση 95 διαφορετικών πηγών άνθρακα από τους μακρομύκητες με τη χρήση της μεγάλης αποδοτικότητας μεταβολικής ανάλυσης FF Biolog επέτρεψε την αρχική χαρτογράφηση του μεταβολισμού τους και τον περεταίρω ορθότερο σχεδιασμό του μέσου ανάπτυξης για την παραγωγή βιομάζας. Αφού αξιολογήθηκαν και διαφορετικές πηγές αζώτου (απλές και σύνθετες), διερευνήθηκε η βέλτιστη σύνθεση του μέσου ανάπτυξης για μέγιστη παραγωγή μυκηλιακής βιομάζας με τη μεθοδολογία της επιφανειακής απόκρισης (RSM), βασιζόμενη σε κεντρικό πειραματικό σχεδιασμό. Μετά τη δοκιμή του άριστου μέσου ανάπτυξης σε κλίμακα βιοαντιδραστήρα διαλείποντος έργου συνεχούς ανάδευσης όγκου 20 L, η παραγωγή βιομάζας έλαβε τη μέγιστη τιμή 10.1 g/L μετά από 112 h για την περίπτωση του G. australe, και 39.2 g/L μετά από 68 h καλλιέργειας για το P. ostreatus. Η παραγωγικότητα δε, αυξήθηκε κατά 60% και 79%, αντίστοιχα για το G. australe και το P. ostreatus. Λαμβάνοντας υπόψη το έντονο ενδιαφέρον για την αξιοποίηση των μακρομυκήτων στη βιομηχανία τροφίμων και φαρμάκων, μελετήθηκε ακόμα η σύσταση της βιομάζας από την ανάπτυξη των δύο στελεχών μακρομυκήτων στο βιοαντιδραστήρα ως προς το περιεχόμενό τους σε βιολειτουργικά συστατικά (π.χ. διαιτητικές ίνες, α- και β- γλουκάνες, πρωτεΐνες, διατροφικά πολύτιμα λιπαρά οξέα) Μάλιστα, στις μυκηλιακές δομές και των δύο στελεχών μακρομυκήτων ανακτήθηκαν φαρμακοδιατροφικά συστατικά που σε πολλές περιπτώσεις τα ποσοστά τους βρέθηκαν υψηλότερα σε σχέση με των αντίστοιχων καρποσωμάτων που απαντώνται στην φύση. Παράλληλα, με σκοπό την οικονομική συμφέρουσα μέγιστη απόδοση διατροφικά πολύτιμων βιοενεργών πολυσακχαριτών, μελετήθηκε η επίδραση διαφορετικών πηγών άνθρακα και αζώτου στο μέσο ανάπτυξης για την παραγωγή αυτών σε συνθήκες ΥΒΚ. Τέλος, το αντικείμενο της διατριβής κινήθηκε στην επιστημονική περιοχή των φυσικών προϊόντων μικροβιακής προέλευσης, την απομόνωσή τους και τη δομική ταυτοποίησή τους. Με σκοπό την απομόνωση και ταυτοποίηση των μεταβολιτών που παράχτηκαν από τους δύο μακρομύκητες σε συνθήκες YBK σε βιοαντιδραστήρα διεξάχθηκε εκχύλιση της συλλεγόμενης βιομάζας με κατάλληλους οργανικούς διαλύτες. Ο χρωματογραφικός διαχωρισμός των εκχυλισμάτων βασίστηκε κυρίως σε χρωματογραφικές τεχνικές [π.χ. υγρή χρωματογραφία ανοιχτής στήλης, παρασκευαστική TLC και HPLC, υγρή χρωματογραφία μέσης πίεσης (MPLC), χρωματογραφία μοριακού αποκλεισμού σε στήλη Sephadex LH-20, χρωματογραφία προσρόφησης με ρητίνη τύπου XAD-4, χρωματογραφία κατανομής με φυγοκέντριση (FCPC)]. Για την ταυτοποίηση των ουσιών που απομονώθηκαν χρησιμοποιήθηκαν φασματοσκοπικές τεχνικές (13C-NMR, 1H-NMR, και 2D NMR, ESI-HRMS), χημικές συσχετίσεις σε συνδυασμό με τις GC/MS αναλύσεις και συγκρίσεις με βιβλιογραφικά δεδομένα. Όλοι οι μεταβολίτες που απομονώθηκαν βρίσκουν ευρύ φάσμα εφαρμογών στη βιομηχανία τροφίμων, φαρμάκων και καλλυντικών βασιζόμενοι σε βιβλιογραφικά δεδομένα. Συγκεκριμένα, από το μυκήλιο του G. australe, απομονώθηκαν και ταυτοποιήθηκαν συνολικά 5 μεταβολίτες. 2 τερπενοειδή μόρια και 3 λιπαρά οξέα. Για πρώτη φορά αναφέρεται η παρουσία του 9-παλμιτολεϊκού οξέος και της εργοστα-5,7,22-τριεν-3β-όλης στο μυκήλιο, ενώ το 19-οκτακοσενοϊκό οξύ απομονώθηκε για πρώτη φορά από το G. australe. Από το μυκήλιο του P. ostreatus, απομονώθηκαν και ταυτοποιήθηκαν συνολικά 18 μεταβολίτες, και συγκεκριμένα: λιπαρά οξέα και οι αντίστοιχοι εστέρες τους, 4 φαινολικοί μεταβολίτες, 3 αλκαλοειδή και 2 νουκλεοτίδια. Η trans-3,4-διυδρο-3,4,8-τριυδροξυναφθαλεν-1(2Η)-όνη, το ινδολο-3-καρβοξυλικό οξυ, η 3-φορμύλ-πυρρόλη και το π-υδροξυ-βενζοϊκό οξύ αποτελούν φυσικά προϊόντα που απομονώθηκαν για πρώτη φορά από το P. ostreatus. Συνοψίζοντας, η προτεινόμενη διεργασία ανάπτυξης του G. australe και του P. ostreatus σε συνθήκες YBK οδήγησαν σε υψηλή παραγωγή βιομάζας πλούσια σε βιοενεργούς μεταβολίτες. Επιπλέον, τα ευρήματα της παρούσας διατριβής θέτουν τη βάση και για μια ελκυστικά συμφέρουσα και αποδοτική προσέγγιση παραγωγής αυτών των χρήσιμων φυσικών προϊόντων σε συνθήκες ΥΒΚ σε βιομηχανική κλίμακα.

The current dissertation focuses on two promising Greek strains of Basidiomycetes growing in submerged liquid cultures, aiming at their biotechnological application in discovery of natural products. Specifically, it was investigated the cosmopolitan edible Pleurotus ostreatus and the wild, medicinal Ganoderma australe. Both strains which were of Greek origin, were obtained from the ATHUM Culture Collection of Fungi of the National and Kapodistrian University of Athens (P. ostreatus ATHUM 4438 and G. australe ATHUM 4345) and are studied for the first time. The primary objective of the study was oriented to identify the most suitable culture medium for maximum biomass production for both strains. The Biolog FF MicroPlate was used to screen 95 different carbon sources for growth monitoring. The pattern of substrate catabolism formed a substrate assimilation fingerprint which was useful in selecting components for media optimization of maximum biomass production. Response surface methodology (RSM), based on the central composite design was applied to explore the optimum concentrations of carbon and nitrogen sources of culture medium. When the improved culture medium was tested in a 20 L stirred tank bioreactor, the biomass reached its maximum value 10.1 g/L after 112 h and 39.2 g/L after 68 h of growth in the cases of G. australe and P. ostreatus, respectively. Additionally, the productivity was increased by 60% and 79% for the G. australe and P. ostreatus bioprocess, respectively.Considering the interest of mushrooms for using them as food supplements, this work also demonstrates the nutraceutical composition (e.g. dietary fibers, α- and β- glucans, proteins, essential fatty acids) of biomass obtained by submerged fermentation of the studied strains in bioreactor. Indeed, in many cases, nutraceuticals were obtained in highest levels in the mycelium comparing with those of corresponding fruitbodies found in nature. In addition, it was investigated the effect of carbon and nitrogen sources on the production of bioactive dietary fibres and glucans in submerged cultures of both strains.Finally, this study presents the isolation and identification of compounds derived from biomass obtained by submerged fermentation of both strains in bioreactor. For this purpose, the biomass extracted with suitable organic solvents. The chromatographic separation of extracts was mainly based on different techniques [e.g. flash column chromatography, preparative TLC and HPLC, medium pressure liquid chromatography (MPLC), Sephadex LH-20 column chromatography, adsorption chromatography using as sorbent resin XAD-4, fast centrifugal partition chromatography (FCPC)]. The pure compounds were elucidated with 13C-NMR, 1H-NMR, 2D NMR-spectroscopic analyses, ESI-HRMS, chemical correlations combined with GC/MS experiments and direct comparison with the respective literature. Based on existing literature data, all compounds isolated exert numerous health benefits. Specifically, the fractionation of the G. australe extract led to the isolation of 5 metabolites; 2 terpenoids and 3 fatty acids. It is reported for the first time the presence of 9-palmitoleic acid and ergosta-5,7,22-trien-3β-ol in the mycelium of G. australe, while 19-octacosenoic acid has not been isolated again from this mushroom strain. Besides, from the mycelium of P. ostreatus, 19 metabolites (fatty acids and their esters, 4 phenolic metabolites, 2 nucleotides and 3 alkaloids) were isolated and identified. An interesting observation was that trans 3,4-dihydro-3,4,8-trihydroxynapthalen-1(2H)-one, indolo-3-carboxylic acid, 3-formyl-pyrrole and 4-hydroxy-benzoic acid were isolated for the first time from P. ostreatus.From the data presented herein, the findings of this study are regarded valuable, as the established fermentation process led to the efficient production of biomass by the studied strains containing bioactive natural products. This work indicates the great potentiality of the established bioprocess for the production of G. australe and P. ostreatus mycelia with enhanced metabolic profile.