Εκχύλιση βιοδραστικών ενώσεων από το άγριο τριαντάφυλλο (Rosa canina L.) με χρήση κυτταρινολυτικών ενζύμων

Γιαννίκα, Βασιλική; Giannika, Vasiliki

dc.contributor.author	Γιαννίκα, Βασιλική	el
dc.contributor.author	Giannika, Vasiliki	en
dc.date.accessioned	2023-01-09T09:06:36Z
dc.identifier.uri	https://dspace.lib.ntua.gr/xmlui/handle/123456789/56550
dc.identifier.uri	http://dx.doi.org/10.26240/heal.ntua.24248
dc.rights	Default License
dc.subject	Ενζυμικά Υποβοηθούμενη Εκχύλιση (ΕΥΕ)	el
dc.subject	Καρπός άγριου τριαντάφυλλου (Rosa canina L.)	el
dc.subject	Ολικό περιεχόμενο σε φαινολικές ενώσεις (TPC)	el
dc.subject	Ολικό περιεχόμενο σε φλαβονοειδή (TFC)	el
dc.subject	Περιγεγραμμένος κεντρικός σύνθετος σχεδιασμός (CCC)	el
dc.subject	Enzyme-Assisted Extraction (EAE)	en
dc.subject	Total Phenolic Content (TPC)	en
dc.subject	Total Flavonoid Content (TFC)	en
dc.subject	Rose hip of wild rose (Rosa canina L.)	en
dc.subject	Central Composite Circumscribed design (CCC)	en
dc.title	Εκχύλιση βιοδραστικών ενώσεων από το άγριο τριαντάφυλλο (Rosa canina L.) με χρήση κυτταρινολυτικών ενζύμων	el
dc.title	Extraction of bioactive compounds from rosehip (Rosa canina L.) with the use of cellulolytic enzymes	en
heal.type	bachelorThesis
heal.classification	Χημική Μηχανική	el
heal.classification	Βιοτεχνολογία	el
heal.classification	Chemical Engineering	en
heal.classification	Biotechnology	en
heal.dateAvailable	2024-01-08T22:00:00Z
heal.language	el
heal.access	embargo
heal.recordProvider	ntua	el
heal.publicationDate	2022-09-29
heal.abstract	Σκοπό της παρούσας διπλωματικής εργασίας αποτελεί η μελέτη διαφόρων παραμέτρων, όπως ο χρόνος εκχύλισης, η αναλογία στερεού-υγρού, το ενζυμικό φορτίο και η κοκκομετρία της πρώτης ύλης, οι οποίοι επηρεάζουν την Ενζυμικά Υποβοηθούμενη Εκχύλιση (ΕΥΕ) βιοδραστικών ενώσεων από το περικάρπιο του καρπού της αγριοτριανταφυλλιάς (Rosa canina L.) Η ολοένα και αυξανόμενη ζήτηση στις βιομηχανίες φαρμάκων, καλλυντικών και συμπληρωμάτων διατροφής έχει εντείνει την ερευνητική δραστηριότητα αναφορικά με την παραλαβή βιοδραστικών ενώσεων από φαρμακευτικά φυτά, συμπεριλαμβανομένου και του άγριου τριαντάφυλλου. Ο καρπός του κυνόροδου R. canina L. περιέχει πληθώρα βιοενεργών συστατικών, όπως φαινολικά οξέα, φλαβονοειδή, γαλακτολιπίδια, τριτερπενικά οξέα, βιταμίνες A, C & E, καροτενοειδή, σάκχαρα, μεταλλικά στοιχεία κ.λπ.. Συνεπώς, τα εκχυλίσματα των καρπών εμφανίζουν ισχυρές αντιοξειδωτικές, αντιφλεγμονώδεις, ανοσοτροποποιητικές, αντιδιαβητικές, αντικαρκινικές, καρδιοπροστατευτικές, νευροπροστατευτικές και αντιμικροβιακές ιδιότητες. Η Ενζυμικά Υποβοηθούμενη Εκχύλιση βασίζεται στη χρήση υδρολυτικών κυρίως ενζύμων στοχεύοντας στην αποικοδόμηση του ανθεκτικού κυτταρικού τοιχώματος της φυτικής μήτρας, και πλεονεκτεί έναντι των συμβατικών μεθόδων εκχύλισης, λόγω της αποφυγής της χρήσης τοξικών οργανικών διαλυτών, των ήπιων λειτουργικών συνθηκών και των ενισχυμένων αποδόσεων χάρη στην υψηλή εκλεκτικότητα των ενζύμων. Αρχικά, πραγματοποιήθηκε η ανάλυση σύστασης της πρώτης ύλης, δηλαδή του αποξηραμένου περικαρπίου του καρπού της R. canina L.. Σύμφωνα με το πρωτόκολλο του NREL, η περιεκτικότητα των υδατοδιαλυτών ενώσεων ανήλθε στο 40.3% β/β (ξ.β.) και η περιεκτικότητα σε κυτταρίνη εκτιμήθηκε στο 9.9% β/β (ξ.β.). Το πρωτεϊνικό περιεχόμενο προσδιορίστηκε με τη μέθοδο Kjeldhal στο 7.5% β/β (ξ.β.), ενώ τα ελεύθερα σάκχαρα που ανιχνεύτηκαν με την υγρή χρωματογραφία υψηλής απόδοσης ήταν η γλυκόζη (2.3 g/100 g πρώτης ύλης) και η φρουκτόζη (3.3g/100 g π.υ.). Οι Ενζυμικά Υποβοηθούμενες Εκχυλίσεις πραγματοποιήθηκαν με τη χρήση του ενζυμικού σκευάσματος Cellic CTec3 της Novozymes, το οποίο συνιστά σύμπλεγμα κυτταρινασών και ημικυτταρινασών. Ειδικότερα, διεξήχθησαν τέσσερις πειραματικές σειρές, στις οποίες εξετάστηκε η επίδραση της κοκκομετρίας της πρώτης ύλης, της αναλογίας στερεού-υγρού και του ενζυμικού φορτίου ταυτόχρονα με την επίδραση του χρόνου εκχύλισης. Η θερμοκρασία και το pH του διαλύτη επιλέχθηκαν έτσι ώστε να βρίσκονται στα αντίστοιχα βέλτιστα εύρη για το ενζυμικό σκεύασμα, ενώ ο ρυθμός ανάδευσης ρυθμίστηκε στις 180 rpm. Έπειτα, τα εκχυλίσματα χαρακτηρίστηκαν ως προς το ολικό περιεχόμενο φαινολικών ενώσεων (TPC) με τη μέθοδο Folin-Ciocalteu, το ολικό περιεχόμενο φλαβονοειδών ενώσεων (TFC) με τη χρωματομετρική μέθοδο χλωριούχου αργιλίου και την αντιοξειδωτική δράση μέσω της μεθόδου προσδιορισμού της ικανότητας δέσμευσης της ρίζας DPPH. Κατά τη μελέτη επίδρασης της κοκκομετρίας της πρώτης ύλης εξετάστηκαν τρία διαφορετικά εύρη κοκκομετρίας (<500 μm, 500-600 μm και 850-1000 μm) για σταθερή αναλογία στερεού-υγρού (3% β/ο) και σταθερό ενζυμικό φορτίο (10 FPU/g πρώτης ύλης). Προέκυψε ότι η εκχύλιση πρακτικά τερματίζεται στο χρονικό διάστημα μεταξύ των 2 και 6 h, ενώ για μικρότερους κόκκους στερεού απαιτείται λιγότερος χρόνος εκχύλισης. Οι μέγιστες αποδόσεις TPC κυμάνθηκαν στο εύρος 136.2-157.8 mg γαλλικού οξέος/g π.υ., οι μέγιστες αποδόσεις TFC στο εύρος 135.7-152.5 mg κατεχίνης /g π.υ. και η μέγιστη αντιοξειδωτική δράση στο εύρος δεικτών IC50 0.83-1.08 μl εκχυλίσματος/ml διαλύματος. Διαπιστώθηκε ότι όσο μικρότερη είναι η κοκκομετρία της πρώτης ύλης, τόσο περισσότερο αυξάνεται η απόδοση της εκχύλισης φαινολικών και φλαβονοειδών ενώσεων, καθώς και ενώσεων με αντιοξειδωτική δράση. Στο πείραμα της μελέτης επίδρασης της αναλογίας στερεού-υγρού εξετάστηκαν οι συγκεντρώσεις στερεής πρώτης ύλης: 2, 4, 6 και 8% β/ο σε σταθερό ενζυμικό φορτίο 2.5 FPU/g πρώτης ύλης και σε κοκκομετρία <500 μm. Προέκυψε ότι η εκχύλιση πρακτικά τερματίζεται στο χρονικό διάστημα μεταξύ των 6 και 8 h. Οι μέγιστες τιμές TPC κυμάνθηκαν στο εύρος 138.3-158.9 mg γαλλικού οξέος/g π.υ, καθώς και υπολογίστηκε αύξηση της απόδοσης TPC της τάξης του 90-183% συγκριτικά με τα αντίστοιχα υδροαιθανολικά εκχυλίσματα της συμβατικής εκχύλισης. Οι μέγιστες τιμές TFC κυμάνθηκαν στο εύρος 123.1-133.1 mg κατεχίνης/g π.υ, καθώς και υπολογίστηκε αύξηση της απόδοσης TFC της τάξης του 119-133% συγκριτικά με τα αντίστοιχα υδροαιθανολικά εκχυλίσματα. Διαπιστώθηκε ότι όσο αυξάνεται η συγκέντρωση της στερεής πρώτης ύλης, τόσο αυξάνεται η συγκέντρωση ανά μονάδα όγκου εκχυλίσματος των εκχυλιζόμενων βιοδραστικών ενώσεων, ενώ αντίθετα παρατηρείται μείωση της απόδοσης ανά μονάδα μάζας στερεού εξαιτίας των περιορισμών που προκαλεί το υψηλό ιξώδες στα φαινόμενα μεταφορά μάζας. Στο πείραμα της μελέτης επίδρασης των υψηλών αναλογιών στερεού-υγρού εξετάστηκαν οι συγκεντρώσεις στερεής πρώτης ύλης: 20, 25, 33.3 και 50% β/ο σε σταθερό ενζυμικό φορτίο 1% ο/ο και σε κοκκομετρία <500 μm . Προέκυψε ότι για υψηλές συγκεντρώσεις στερεού απαιτούνται σημαντικά μεγαλύτεροι χρόνοι εκχύλισης. Οι μέγιστες αποδόσεις TPC κυμάνθηκαν στο εύρος 127.8-171.3 mg γαλλικού οξέος/g π.υ. και οι μέγιστες αποδόσεις TFC στο εύρος 124.0-163.7 mg κατεχίνης /g π.υ.. Διαπιστώθηκε ότι για πολύ υψηλές αναλογίες στερεού-υγρού προέκυψαν πολύ ιξώδη συστήματα γεγονός που δυσχέρανε την υδρόλυση της φυτικής μήτρας από τα ένζυμα. Στο πείραμα της μελέτης επίδρασης του ενζυμικού φορτίου εξετάστηκαν οι ενζυμικές συγκεντρώσεις 0.5, 1, 1.5, 2 % ο/ο για σταθερή συγκέντρωση πρώτης ύλης 25% β/ο σε κοκκομετρία <500 μm . Οι μέγιστες αποδόσεις TPC κυμάνθηκαν στο εύρος 161.0-192.6 mg γαλλικού οξέος/g π.υ. και οι μέγιστες αποδόσεις TFC στο εύρος 114.0-147.7 mg κατεχίνης /g π.υ.. Διαπιστώθηκε ότι όσο αυξάνεται η ενζυμική συγκέντρωση αυξάνονται αναλογικά και οι αποδόσεις TPC & TFC, καθώς και η αντιοξειδωτική δράση των εκχυλισμάτων, γεγονός που υποδεικνύει ότι το εύρος των ενζυμικών φορτίων που μελετήθηκε είναι μικρότερο από τη βέλτιστη ενζυμική συγκέντρωση. Τέλος, εφαρμόστηκε ο περιγεγραμμένος κεντρικός σύνθετος σχεδιασμός (CCC) τριών παραγόντων, στον οποίο μελετήθηκε η ταυτόχρονη επίδραση της αναλογίας στερεού-υγρού (εύρος 6.6-23.4 % β/ο) , του χρόνου εκχύλισης (εύρος 0.6-7 h) και του ενζυμικού φορτίου (εύρος 0.2-1.8 % ο/ο) με στόχο τη μεγιστοποίηση των αποδόσεων TPC & TFC και της αντιοξειδωτικής δράσης. Οι μετρήσεις της απόδοσης TPC προσαρμόστηκαν ικανοποιητικά σε δευτεροβάθμιο μοντέλο (R2=0.7473), ενώ η ανάλυση διακύμανσης (ANOVA) επιβεβαίωσε ότι ο χρόνος εκχύλισης έχει σημαντική επίδραση στην τιμή TPC (p<0.0001), καθώς και η αναλογία στερεού-υγρού (p=0.0036). Οι μετρήσεις δεικτών IC50 προσαρμόστηκαν πολύ καλά σε δευτεροβάθμιο μοντέλο (R2=0.8808), ενώ ισχυρότερη επίδραση στην αντιοξειδωτική δράση εμφανίζει η αναλογία στερεού-υγρού (p<0.0001). Από τη βελτιστοποίηση διαπιστώθηκε ότι, οι μέγιστες δυνατές τιμές των εξαρτημένων μεταβλητών είναι TFC = 127.005 mg κατεχίνης/g π.υ., TPC = 152.554 mg γαλλικού οξέος/g π.υ. και αντιοξειδωτική ικανότητα με δείκτη IC50= 0.13752 μL εκχυλίσματος/mL δείγματος και επιτυγχάνονται εφαρμόζοντας χρόνο εκχύλισης 6 h, ενζυμικό φορτίο 1.5% ο/ο και αναλογία στερεού-υγρού 18% β/ο.	el
heal.abstract	The aim of this diploma thesis is the study of various parameters, such as the extraction time, the solid-liquid ratio, the enzymatic concentration and the particle size of the raw material, which affect the Enzyme-Assisted Extraction (EAE) of bioactive compounds from the rose hip shell of wild rose (Rosa canina L.). The increasing demand in the pharmaceutical, cosmetic, and dietary supplement industries has intensified research activity regarding the extraction of bioactive compounds from medicinal plants, including wild rose. The rose hip of the dogrose R. canina L. is rich in bioactive components such as phenolic acids, flavonoids, galactolipids, triterpene acids, vitamins A, C & E, carotenoids, carbohydrates, minerals, etc. Therefore, rose hip extracts exhibit strong antioxidant, anti-inflammatory, immunomodulatory, antidiabetic, anticancer, cardioprotective, neuroprotective, and antimicrobial properties. Enzyme-Assisted Extraction is based on the use of mainly hydrolytic enzymes with the aim of disrupting the recalcitrant cell wall of the plant matrix, which consists of polysaccharides. The EAE of the R. canina L. rose hip is advantageous over conventional extraction methods due to the avoidance of the use of toxic organic solvents, the protection of thermolabile bioactive compounds in the mild operating conditions, the enhanced yields thanks to the high substrate specifity of the enzymes, etc. Initially, the compositional analysis of the rose hip shell of R. canina L. was performed. According to the NREL protocol, the water-soluble compound content amounted to 40.3% w/w on a dry basis, and the cellulose content was estimated to be 9.9% w/w (d.b.). The protein content was determined by the Kjeldhal method at 7.5% w/w (d.b.), while the free sugars detected by high-performance liquid chromatography were glucose (2.3g/100graw material) and fructose (3.3g/100gr.m.). The Enzyme-Assisted Extractions were carried out using the enzymatic mixture Cellic CTec3 from Novozymes, which is a complex of cellulases and hemicellulases, while the raw material was the dried rose hip shell of R. canina L.. In particular, four experimental series were conducted, in which the effects of raw material particle size, solid-liquid ratio, and enzymatic concentration were investigated concurrently with the effect of extraction time. The temperature and pH of the solvent were selected to be in the respective optimal ranges οf the enzymatic mixture, while the stirring rate was set at 180 rpm. Subsequently, the extracts were characterized in terms of total phenolic content (TPC) with the Folin-Ciocalteu method; total flavonoid content (TFC) with the aluminum chloride colorimetric method; and antioxidant activity by determining the DPPH radical scavenging capacity. In the study of the effect of raw material particle size, three different particle size ranges (<500 µm, 500-600 µm and 850-1000 µm) were examined at a constant solid-liquid ratio (3% w/v) as well as at a constant enzymatic concentration (10 FPU/g r.m.). The results showed that the extraction is practically terminated in the time interval between 2 and 4 h, while for smaller particle sizes less extraction time is required. The maximum TPC yields were determined in the range of 136.2-157.8 mg gallic acid/g r.m., the maximum TFC yields in the range 135.7-152.5 mg catechin/g r.m. and the maximum antioxidant activity in the IC50 index range of 0.83-1.08 μl extract/ml solution. It is interesting to mention that a decrease in the particle size of the raw material increases the efficiency of the extraction of phenolic and flavonoid compounds, as well as compounds with antioxidant activity. In the study of the effect of the solid-liquid ratio, four solid raw material concentrations were examined: 2, 4, 6 and 8% w/v in powder form (<500 μm) and at constant enzymatic concentration (2.5 FPU/g r.m.). The results indicated that the extraction is practically terminated in the time interval between 6 and 8 h. The maximum TPC values were determined in the range of 138.3-158.9 mg gallic acid/g r.m., and an increase in TPC yield of 90-183% was calculated compared to the corresponding hydroethanolic extracts of the conventional extraction. The maximum TFC values were determined in the range of 123.1-133.1 mg catechin/g r.m., and an increase in TFC yield of 119-133% compared to the corresponding hydroethanolic extracts was calculated. The findings showed that as the concentration of the solid raw material increases, the concentration per unit volume of extract of the bioactive compounds also increases, while, on the contrary, a decrease in the yield per unit mass of solid is observed due to the limitations caused by the high viscosity in the mass transfer phenomena. In the study of the effect of high solid-liquid ratios, four concentrations of solid raw material were examined: 20, 25, 33.3 and 50% w/v in powder form (<500 μm) and at constant enzymatic concentration (1% v/v). The results revealed that for high solid concentrations, significantly longer extraction times are required. The maximum TPC yields ranged from 127.8-171.3 mg gallic acid/g r.m. and the maximum TFC yields were determined in the range of 124.0-163.7 mg catechin/g r.m.. It is noteworthy to mention that very high solid-liquid ratios result in extremely viscous systems, which hinder the hydrolyzation of the plant matrix by the enzymes. In the study of the effect of the enzyme loading, four enzyme concentrations were examined: 0.5, 1, 1.5, 2 % v/v at constant raw material concentration (25% w/v) in powder form (<500 μm). The maximum TPC yields ranged from 161.0-192.6 mg gallic acid/g r.m. and the maximum TFC yields were determined in the range of 114.0-147.7 mg catechin /g r.m.. The results noted that as the enzyme concentration increases, the TPC and TFC yields increase proportionally, as well as the antioxidant activity of the extracts, which indicates that the range of enzyme loadings studied is less than the optimal enzyme concentration. Finally, the Central Composite Circumscribed design (CCC) of three factors was applied, in which the simultaneous effect of solid-liquid ratio (range 6.6-23.4 % w/v), extraction time (range 0.6-7 h) and enzymatic concentration was studied (range 0.2-1.8% v/v), with the goal of increasing the TPC and TFC yields as well as the antioxidant activity. The TPC yield measurements were adequately fitted to a quadratic model (R2=0.7473), while the analysis of variance (ANOVA) confirmed that the extraction time has a significant effect on the TPC value (p<0.0001), as well as the solid-liquid ratio (p=0.0036). The measurements of IC50 indices fitted very well to a quadratic model (R2=0.8808) and the solid-liquid ratio showed a stronger effect on the antioxidant activity (p<0.0001). The optimization indicated that the maximum possible values of the dependent variables are TFC = 127,005 mg catechin/g r.m., TPC = 152,554 mg gallic acid/g r.m. and antioxidant capacity with an index of IC50= 0.13752 μL extract/mL sample. The best results were obtained when applying an extraction time of 6 h, an enzymatic concentration of 1.5% v/v and a solid-liquid ratio of 18% w/v.	en
heal.advisorName	Μαμμά, Διομή	el
heal.committeeMemberName	Μαγουλάς, Κωνσταντίνος	el
heal.committeeMemberName	Δέτση, Αναστασία	el
heal.academicPublisher	Εθνικό Μετσόβιο Πολυτεχνείο. Σχολή Χημικών Μηχανικών. Τομέας Σύνθεσης και Ανάπτυξης Βιομηχανικών Διαδικασιών (IV)	el
heal.academicPublisherID	ntua
heal.numberOfPages	166 σ.	el
heal.fullTextAvailability	false