Φασματοσκοπική μελέτη ιστών και βιοϋλικών

Abstract

Στην παρούσα διατριβή μελετήθηκαν με υπέρυθρη φασματοσκοπία με μετασχηματισμό Fourier (Fourier transform infrared, FT-IR) σε συνδυασμό με ηλεκτρονιακό μικροσκόπιο σάρωσης συνδεδεμένο με στοιχειακό αναλυτή (SEM, EDAX) αθηρωματικές πλάκες στεφανιαίων και καρωτίδων αρτηριών, ασθενών που υποβλήθηκαν σε bypass επεμβατική αποκατάσταση και ενδαρτηρεκτομή. Σκοπός της εργασίας ήταν η προσέγγιση και πιθανή απάντηση στον μηχανισμό αθηρογένεσης των στεφανιαίων και καρωτίδων αρτηριών, ώστε να αντιμετωπισθεί διατροφικά ή φαρμακευτικά η ασθένεια. Για την μελέτη σχηματίσθηκε κατάλληλο πρωτόκολλο με βάση το ιατρικό ιστορικό των ασθενών. Οι ασθενείς κατηγοριοποιήθηκαν με βάση την ηλικία, το φύλλο, το βάρος και τα αιματολογικά και βιοχημικά δεδομένα. Σχεδόν το σύνολο των ασθενών ήταν καπνιστές (92%) και υπέρβαροι (94%). Τα πειραματικά δεδομένα των FT-IR φασμάτων ήταν εντυπωσιακά και έδειξαν ότι η έναρξη και εξέλιξη της αθηρωματικής πλάκας οφείλεται στην υπεροξείδωση των λιπιδίων και πρωτεϊνών των μεμβρανών, σύμφωνα με τις μεταβολές που παρατηρήθηκαν στην περιοχή του φάσματος 1800-1500 cm-1. Η επίδραση των ελευθέρων ριζών προκαλεί αρχικά βλάβη στην δευτεροταγή δομή τους, με αποτέλεσμα την επέκταση της βλάβης και σε άλλα βιολογικά μόρια. Η επίδραση των ελευθέρων ριζών στις μεμβράνες προκαλεί σχάση του μήκους των ανθρακικών αλυσίδων των μεγαλομορίων που σχηματίζουν τις μεμβράνες, καταστρέφοντας την ευκινησία και την ρευστότητα των μεμβρανών με αποτέλεσμα την καταστροφή του κυττάρου. Η εμφάνιση της νέας ταινίας στα περίπου 3080 cm-1 αποδίδεται στην παραγωγή ελευθέρων ρίζών υδροξυλίου, οι οποίες μετά από απόσπαση ατόμων υδρογόνου από τις ανθρακικές αλυσίδες των λιπιδίων, οδηγεί στο σχηματισμό ένωσης με τερματικό άτομο άνθρακα ολεφινικού χαρακτήρα (=CH). H ένταση της ταινίας της ολεφινικής ομάδας είναι συνάρτηση της κλινικά υπολογισμένης LDL χοληστερόλης των ασθενών. Η παραπάνω ταινία καθώς και η ταινία στα 1735 cm-1 μπορούν να αποτελέσουν δείκτες για την LDL χοληστερόλη. Μετά από διάλυση των αθηρωμάτων σε οργανικούς διαλύτες, η FT-IR φασματοσκοπία έδειξε ότι οι apoΑ πρωτεΐνες διαλύονται στα συσσωματώματα των λιποειδών ενώσεων με αποτέλεσμα να παρεμποδίζεται η φυσιολογική λειτουργία της HDL χοληστερόλης. Για τους υπερουρικαιμικούς (αυξημένο ουρικό οξύ στον ορό του αίματος) ασθενείς διαπιστώθηκε, από τα προϊόντα των αθηρωματικών πλακών, ότι υπερπαράγονται ελεύθερες υπερόξυ ρίζες (Ο2-·) με αποτέλεσμα την παρεμπόδιση της λειτουργίας των μολυβδαινοενζύμων. Η παρατήρηση αυτή ενισχύθηκε και από την ανίχνευση μολυβδαινίου στις αθηρωματικές πλάκες των υπερουρικαιμικών ασθενών. Οι ελεύθερες ρίζες Ο2-· φαίνεται ότι μεταβάλλουν την οξειδωτική κατάσταση του μολυβδαινίου, που αποτελεί το ενεργό κέντρο των μολυβδαινοενζύμων, με αποτέλεσμα την αδρανοποίησή τους. Η αδρανοποίηση των μολυβδαινοενζύμων συνεπάγεται την κατανάλωση των ενδογενών προστατευτικών ενώσεων, όπως είναι οι γλουταθειόλες. Αυτό επιβεβαιώνεται από την αύξηση της έντασης της ταινίας του φάσματος στην περιοχή 600-400 cm-1 όπου απαντούν οι χαρακτηριστικές ταινίες των C-S ομάδων των θειολών και των S-S ομάδων των δισουλφιδίων, προϊόντα οξείδωσης των θειολών (GSH) κατά την αντίδρασή τους με τις ελεύθερες ρίζες υδροξυλίου (ΗΟ·). Η SEM ανάλυση έδειξε ότι η αρχιτεκτονική των αθηρωματικών πλακών είναι πλούσια σε μεταλλικά άλατα και ινίδια. Οι αθηρωματικές πλάκες είναι πλούσιες σε ανθρακικό ασβέστιο, όπως φαίνεται από τις ταινίες στα 1460 cm-1, 874 cm-1 και 710 cm-1 (δεν διακρίνεται επειδή είναι ασθενής) οι οποίες αντιστοιχούν στις δονήσεις τάσης και κάμψης των ανθρακικών ιόντων CO32-. Η EDAX ανάλυση έδειξε την παρουσία τοξικών μεταλλικών ιόντων, όπως χρώμιο, νικέλιο, κ.ά, τα οποία συνδέθηκαν με το εργασιακό περιβάλλον των ασθενών. Συμπερασματικά, φαίνεται ότι η υπέρυθρη φασματοσκοπία μπορεί να αποτελέσει μια ακριβή μέθοδο μελέτης της εξέλιξης της νόσου και να δώσει σημαντικές πληροφορίες για το εκάστοτε στάδιο, σε συνάρτηση με την κλινική εικόνα του ασθενούς. Από τις μεταβολές των ταινιών τόσο ως προς την ένταση, την μορφή και τις μετατοπίσεις γίνεται εμφανές ότι το οξειδωτικό στρες του οργανισμού και οι παραγόμενες ελεύθερες ρίζες οξυγόνου και υδροξυλίων (δραστικά σωματίδια οξυγόνου, Reactive oxygen speices, ROS) ευθύνονται για την έναρξη της υπεροξείδωσης των μεμβρανών και την περαιτέρω βλάβη του κυττάρου. Σε αντίθεση με τις άλλες ισχύουσες μέχρι σήμερα διαγνωστικές μεθόδους, οι οποίες δίνουν πληροφορίες μόνο για την στένωση και το ρυθμό ανάπτυξης των αθηρωμάτων στις αρτηρίες, η υπέρυθρη φασματοσκοπία δίνει πληροφορίες για το είδος της βλάβης και θα μπορούσε να απαντήσει στην πρόβλεψη για πιθανή αιμορραγική κατάληξη.

Atherosclerosis and its attendant morbidity and mortality remain a global health issue in our society. There are more than 17.5 million deaths worldwide attributable to the cardiovascular complications of this disease. In the present thesis, Fourier Transform Infrared Spectroscopy (FT-IR) and Scanning Electron Microscopy (SEM) with EDAX equipment were used to study atheromatic plaques of coronary and carotid arteries from patients who underwent endarterectomy and bypass surgery. The aim of this work was the study of atheromatic plaques at a molecular level in order to answer some of the questions about the mechanism of atherogenesis of coronary arteries leading to better treatment of the disease. A suitable protocol was made relative to the clinical history of the patients. The patients were grouped according to age, sex, weight, hematological and biochemical data. Almost all of the patients were smokers (92%) and hyperlipidemic (94%). The experimental data from FT-IR spectra were remarkable suggesting that the initial steps of atheromatic plaque formation depends on hyperoxidation of lipids, phospholipids and proteins of membranes. The changes in the spectral range of 4000-2850 cm-1 showed a decrease of hydrophobicity and increase permeability of membranes. The spectra in the region of 1800-1500 cm-1 describes the changes of secondary structure of proteins. From the shift of several bands to lower frequencies it was suggested that the protein helices change their structure from a-helix to random coil depending on the clinical history of the patients. The appearance in the spectra of the band at 3080 cm-1 assigned to v(=CH) indicates that the produced free hydroxyl radicals reacted by hydrogen abstraction with lipids leading to the generation of one terminal double bond (=CH). The intensity of this olefinic bond was strongly associated with the LDL cholesterol in the serum of the patients and with the band at 1735 cm-1, which could be used as marker for LDL cholesterol. FT-IR spectra of atheromas, after dilution in organic solvents showed that apolipiproteins-A (apoA) are diluted in the debris of lipids resulting in the inhibition of the physiological protective role of HDL cholesterol. In the case of hyperuricaemic patients, it was suggested that free hydrogen peroxide and superoxide anion radicals were overproduced, inhibiting the function of molybdoenzymes, as it is shown from the products on atheromatic plaques. This observation was also confirmed from the detection of molybdenum only in the atheromatic plaques of hyperuricaemic patients. It seems that the overproduction of free Ο2-· anion radicals alter the oxidation state of molybdenum the active site of molybdoenzymes resulting to inactivation of the cycle of hypoxanthine to xanthine with uric acid as final product. The inactivation of molybdoenzymes entails the consumption of natural protection factors of humans, such as glutathioles (GSH). This is evidenced from the increase in intensity of the bands in the region 600-400 cm-1, where the characteristic groups of C-S of thiols and S-S of disulfides absorb. Disulfides are the oxidation products of thiols during their reaction with free hydroxyl radicals (ΗΟ·). SEM analysis showed that the architecture of atheromatic plaques is rich in mineral salts and fibrils. Atheromatic plaques are rich in calcium carbonate, as it is suggested from the bands at 1460, 874 cm-1 and 710 cm-1 (very weak) which are attributed to stretching and bending vibrations of carbonyl ions vCO32-, respectively. Furthermore, EDAX analysis showed the presence of heavy metals such as chromium (Cr), lead (Pb), nickel (Ni), which were present in the working environment of the patient, showing the effect of environment on public health. In conclusion, infrared spectroscopy is a promising and accurate method for the study of biological molecules (Biospectroscopy) and the development of the disease, since it provides valuable information for the current state of health and in accordance with patient’s condition. The variations in the intensity, the shape and shifting of the bands indicate that oxidative stress in the organism produced free radicals of oxygen (Reactive Oxyzen Speices, ROS), which are responsible for the initiation of peroxidation of membrane and further damage of the cell. Oxidant stress broadly defines the redox state of the patient achieved when there is an imbalance between antioxidant capacity and reactive oxidant species (ROS), such as reactive oxygen, nitrogen, or halogenating species, and free radical species such as thiyl, tyrosyl, or protein radicals.