Οπτική παγίδα και μικροχειρισμός διηλεκτρικών σωματιδίων και βιολογικών δειγμάτων χρησιμοποιώντας δέσμες laser

Abstract

Στην παρούσα διδακτορική διατριβή μελετήθηκαν τα φαινόμενα πίεσης ακτινοβολίας που επάγει η δέσμη laser σε διηλεκτρικά σωματίδια και βιολογικά δείγματα. Συγκεκριμένα χρησιμοποιήθηκε η δέσμη laser για τον οπτικό μικροχειρισμό κυττάρων, μικροσωματιδίων και νανοσωματιδίων. Οι οπτικές παγίδες αποτελούν ένα μη επεμβατικό εργαλείο για να επιταχύνουν, να επιβραδύνουν, να εκτρέψουν ή και να παγιδεύσουν σωματίδια των οποίων το μέγεθος ποικίλει, όπως άτομα, μικρές διηλεκτρικές σφαίρες, κύτταρα, βακτήρια, χρωμοσώματα και γονίδια. Πρόκειται για ένα υποσχόμενο βιοϊατρικό εργαλείο, που δίνει μία αξιοθαύμαστη ακρίβεια στον έλεγχο των κινήσεων μικροσωματιδίων ή/και νανοσωματιδίων, σε πολλούς τομείς όπου τέτοια σωματίδια είναι πρώτιστης σημασίας. Η μικροδέσμη laser είναι ένα εργαλείο με το οποίο μπορεί κανείς να αποδομεί, να κόβει ή και να «λιώνει» βιολογικό υλικό. Η οπτική παγίδα μπορεί να συνδυαστεί με τη μικροδέσμη laser για την αποδόμηση ή τη μικροχειρουργική επέμβαση βιολογικών δομών. Τα τελευταία χρόνια η μικροδέσμη laser αλλά και η οπτική παγίδα προσφέρουν μια πειραματική προσέγγιση στα βιολογικά προβλήματα που δεν παρέχει καμία άλλη τεχνική μικροχειρισμού, με αποτέλεσμα ο μικροχειρισμός με τη βοήθεια του φωτός να εξελίσσεται, σιγά σιγά, σε βασικό εργαλείο για πολλά πεδία της επιστήμης. Στα πλαίσια αυτής της διατριβής αναπτύχθηκαν δύο συστήματα διπλής δέσμης (οπτική παγίδα-μικροδέσμη laser) στα εργαστήρια της ομάδας «Ανάπτυξης Laser και Εφαρμογών τους» του Τομέα Φυσικής της Σχολής Ε.Μ.Φ.Ε του Ε.Μ.Π. Το πρώτο σύστημα συνδυάζει διάταξη οπτικής παγίδας με laser He-Ne που εκπέμπει στα 632,8 nm με διάταξη μικροδέσμης laser από ένα παλμικό laser N2 με μήκος κύματος εκπομπής στα 337 nm. Το δεύτερο σύστημα συνδυάζει διάταξη οπτικής παγίδας με laser Nd:YAG που εκπέμπει στα 1064 nm με την ίδια διάταξη μικροδέσμης laser που χρησιμοποιήθηκε στο πρώτο σύστημα. Τα δύο συστήματα εφαρμόστηκαν σε κύτταρα μαγιάς, μικροσφαιρίδια PMMA (Poly-methyl-meth-acrylate) και στα φύκια ectacarpus siliculosus. Η επέμβαση της μικροδέσμης laser στα υπό μελέτη σωματίδια, δημιούργησε μικροτομές μεγάλης ακρίβειας. Μετρήθηκε πειραματικά το κατώφλι αποδόμησης των παραπάνω δειγμάτων και μελετήθηκαν θεωρητικά οι μηχανισμοί αποδόμησης. Η οπτική παγίδα αποτελεί από μόνη της ένα πολύ χρήσιμο εργαλείο για το μικροχειρισμό ενός παγιδευμένου σωματιδίου. Η ανάγκη για ταυτόχρονη παγίδευση και μικροχειρισμό περισσοτέρων από ένα σωματίδια, μας οδήγησε στην ανάπτυξη μίας διάταξης πολλαπλής οπτικής παγίδας. Ο σχεδιασμός και η ανάπτυξη της πολλαπλής οπτικής παγίδας που αποτελεί μια απλή και ευέλικτη πειραματική διάταξη, δίνει την εμπειρία ανάπτυξης παρόμοιων συστημάτων αλλά και τη δυνατότητα μελλοντικής προσαρμογής σε πολυπλοκότερα συστήματα. Βασίζεται στη δημιουργία επιμέρους συνιστωσών της κύριας δέσμης της οπτικής παγίδας, όταν αυτή περάσει από ένα σύστημα διαχωριστών δέσμης, με τέτοια διαφορά οπτικών δρόμων, ώστε στο εστιακό επίπεδο του αντικειμενικού φακού να παρουσιάζονται κροσσοί συμβολής. Εφαρμόσαμε τη διάταξη της πολλαπλής οπτικής παγίδας σε νανοσωματίδια πολυστηρενίου και στο βακτηρίο zobellia galactanivorans. Μετρήσαμε δηλαδή, πειραματικά τις οπτικές δυνάμεις που επάγονται στα υπό μελέτη σωματίδια τα οποία είναι παγιδευμένα στους τρεις πρώτους κροσσούς συμβολής, προσδιορίσαμε τον μαθηματικό αλγόριθμο που πηγάζει από τη γεωμετρία της διάταξης και μπορέσαμε και προσδιορίσαμε την οπτική δύναμη που κρατά παγιδευμένο το σωματίδιο στον κύριο κροσσό συμβολής. Στη συνέχεια προσπαθήσαμε να εκμεταλλευτούμε την πλούσια εμπειρία της ομάδας μας σε θέματα αποδόμησης ιστών με μήκος κύματος εκπομπής στα 2,94 μm, γνωρίζοντας ότι η ακτινοβολία αυτή συνδυάζει πολύ καλή αποδομητική δράση με ελαχιστοποίηση των βλαβών του υγιούς περιβάλλοντος ιστού, με σκοπό να μελετηθούν τα χαρακτηριστικά αποδόμησης της μικροδέσμης laser στα 2,94 μm και σε μικροκυτταρικό επίπεδο. Για τη μεταφορά της μικροδέσμης laser από την έξοδο του laser στο σύστημα οπτικής παγίδας, χρησιμοποιήθηκε αρχικά ίνα φθοριούχου γυαλιού ή οποία αντικαταστάθηκε αργότερα από κοίλο κυματοδηγό πυριτίας. Στη χρήση της οπτικής ίνας φθοριούχου γυαλιού και του κοίλου κυματοδηγού πυριτίας καταλήξαμε μετά από διεξοδική μελέτη της κυματοδήγησης της μικροδέσμης laser στα 2,94 μm, μέσα από διάφορα υλικά. Συγκεκριμένα, μελετήθηκαν πειραματικά και θεωρητικά, αναπτύσσοντας κατάλληλο μαθηματικό αλγόριθμο, τα χαρακτηριστικά κυματοδήγησης της μικροδέσμης laser στα 2,94 μm μέσα από κοίλο κυματοδηγό πυριτίας, ενώ μελετήθηκαν μόνο πειραματικά τα ίδια χαρακτηριστικά μέσα από ίνες φθοριούχου γυαλιού και οξειδίου του γερμανίου. Η δέσμη εξόδου μελετήθηκε ως προς την εξασθένηση που εισάγει το κάθε υλικό, τη χρονική και χωρική κατανομή της εξερχόμενης ενέργειας σε συνθήκες ευθείας αλλά και υπό κάμψη διάδοσης. Επιπλέον, προκειμένου να δημιουργηθεί μία οπτική παγίδα που να μην περιορίζεται από τα χαρακτηριστικά διαπερατότητας του συστήματος παρατήρησης, με έναν απλό και οικονομικό τρόπο, αναπτύχθηκε η οπτική παγίδα ίνας. Η οπτική παγίδα ίνας συνδυάστηκε με τη μικροδέσμη laser στα 2,94 μm και το νέο σύστημα εφαρμόστηκε πάνω σε κύτταρα μαγιάς και μικροσφαιρίδια PMMA. Η επίδραση της μικροδέσμης laser στα 2,94 μm στα υπό μελέτη σωματίδια ήταν προφανής, αφού κατάφερε να δημιουργήσει αλλοιώσεις και μικροτομές στους κυτταρικούς πληθυσμούς. Ωστόσο, στο νέο σύστημα αντιμετωπίσαμε δυσκολία ισχυρής παγίδευσης, γιατί υπάρχει το μειονέκτημα της αδυναμίας εστίασης της δέσμης οπτικής παγίδας στο μικρότερο δυνατό όριο (~0,7 μm), αφού πλέον ο αντικειμενικός φακός χρησιμοποιείται μόνο για την παρατήρηση του φαινομένου της παγίδευσης. Στα πλαίσια της διατριβής δημιουργήθηκε η ανάγκη ανίχνευσης της μικροδέσμης laser στα 2,94 μm και της δέσμης οπτικής παγίδας στα 1064 nm. Οι πιο διαδεδομένοι ανιχνευτές δεσμών laser για τα συγκεκριμένα μήκη κύματος είναι οι ανιχνευτές photon drag και optical rectification. Τα φαινόμενα photon drag και optical rectification αποτελούν μία μορφή εκδήλωσης πίεσης ακτινοβολίας και παρουσιάζεται ως ηλεκτρικό πεδίο που μπορεί να μετρηθεί σε ημιαγωγούς όπως γερμάνιο (Ge), πυρίτιο (Si), αρσενίδιο γαλλίου (GaAs) και φωσφίδιο γαλλίου (GaP), στους οποίους έχουν γίνει οι κατάλληλες δύο ηλεκτρικές ωμικές επαφές. Προσδιορίσαμε πειραματικά τους συντελεστές του φαινομένου photon drag και optical rectification για τους ημιαγωγούς που αναφέρονται παραπάνω. Διαπιστώσαμε ότι οι πλέον αποδοτικοί ημιαγωγοί, στα υπόψη μήκη κύματος ήταν οι Ge και GaP και αυτοί χρησιμοποιήθηκαν κυρίως, ως ανιχνευτές ακτινοβολίας. Αντίθετα ο ημιαγωγός Si δεν χρησιμοποιήθηκε ως ανιχνευτής αλλά χρησιμοποιήθηκε μόνο στην προσπάθεια να αναπτυχθεί μία διάταξη ισχυρής οπτική παγίδας επιφανειακών πλασμονίων (plasmonic optical tweezers). Οι απλές οπτικές παγίδες έχουν μετατραπεί σε ένα ισχυρό και ευέλικτο εργαλείο για το μικροχειρισμό σωματιδίων διαστάσεων μερικών μικρομέτρων. Ωστόσο, εισάγουν περιορισμούς όταν οι διαστάσεις του σωματιδίου είναι μικρότερες από το μήκος κύματος της δέσμης του laser παγίδευσης. Προκειμένου να αποτρέψουμε τη διαφυγή ενός σωματιδίου μερικών νανομέτρων, από την παγίδα, αναπτύξαμε διάταξη οπτικής παγίδας επιφανειακών πλασμονίων. Ένα επιφανειακό πλασμόνιο είναι συλλογικές ταλαντώσεις ηλεκτρονιακού νέφους επιφάνειας που διαδίδεται στη διεπιφάνεια μετάλλου και διηλεκτρικού. Στη νέα διάταξη οπτικής παγίδας, δημιουργήσαμε ένα κατάλληλο υπόστρωμα πάνω στο οποίο παγιδεύτηκαν τα σωματίδια πολυστυρενίου μερικών νανομέτρων. Το υπόστρωμα ήταν ένα δισκίο πυριτίου, το οποίο ακτινοβολήθηκε με μικροδέσμη laser στα 266 nm, ώστε να αναπτυχθούν στην επιφάνεια του, μικροδομές (ακίδες-spikes) κατάλληλης γεωμετρίας και περιοδικότητας. Στη συνέχεια εναποθέσαμε πάνω στις μικροδομές ένα πολύ λεπτό στρώμα αργύρου (~80 nm). Η παρουσία του αργύρου στην επιφάνεια των μικροδομών σε συνδυασμό με την περιοδικότητα τους δημιούργησε επιφανειακά πλασμόνια τα οποία ενίσχυσαν την οπτική παγίδα και μας εξασφάλισαν οπτικές δυνάμεις μερικών nN (αντί pN).

This thesis studies the pressure forces of the laser beams, on biological samples and dielectric particles. Specifically, the laser beam is used for micromanipulation of cells, microparticles and nanoparticles. The optical tweezers are a non-contact tool to accelerate, slow down, deviate or trap particles, whose size varies, such as small dielectric spheres, cells, bacteria, chromosomes and genes. The optical tweezers are a promising biomedical tool, giving a remarkable accuracy in controlling the movement of microparticles and/or nanoparticles. The microbeam is a tool with which one can ablate, cut or "melt" biological material. The optical trap can be integrated with the microbeam, for ablation of biological structures. In recent years, the microbeam and the optical tweezers offer solutions to biological problems, which are not provided by any other micromanipulation technique. Part of this thesis was dedicated to the development of two dual beam (optical tweezers-microbeam) systems in the laboratories of our research group "Laser Development and Applications" of the School of Applied Sciences of N.T.U.A. The first system comprises a He-Ne laser, emitting at 632.8 nm, as optical tweezers with the pulsed N2 laser, with emission wavelength at 337 nm being used as microbeam. The second comprises a Nd:YAG laser emitted at 1064 nm as optical tweezers, with the pulsed N2 laser, with emission wavelength at 337 nm being used as microbeam. Both systems were applied to yeast cells, microspheres of PMMA (Poly-methyl-meth-acrylate) and the algae ectacarpus siliculosus. The precise focusing of the microbeam creates minute holes onto the membrane of the floating cells. Experimentally, the threshold ablation of the above samples, was determined. Theoretically, the mechanisms of ablation were studied. The optical trap is a very useful tool for the micromanipulation of one trapped particle. The need for simultaneous trapping and micromanipulation of more than one particles, led us to develop a multiple optical trap. The design and the development of a multiple optical trap is simple and flexible and gives the opportunity of developing similar, but more complex systems with greater potential, in the future. The multiple optical trap based on creating beam components, when passed via a series of beam splitters, induce optical path differences. Thus in the focal plane of the objective lens interference fringes patterns are created. We applied the multiple optical trap on nanoparticles and the bacteria zobellia galactanivorans. We measured experimentally the optical forces of the first three interference fringes. We identified the appropriate mathematical algorithm, for the geometry of the multiple optical trap and we identified the optical forces of the main fringes. Then we exploited the experience of our research group on tissue ablation in the wavelength to 2.94 μm, a wavelength minimizes the damage of healthy tissue, in order to study the influence of 2.94 μm microbeam to the cells. The 2.94 μm laser microbeam was guided to the microscope through optical waveguides. As guiding tool we used a fluoride glass optical fiber and a hollow silica waveguide. The choice of the proper material for waveguiding the radiation, was made after detailed studies of several materials of hollow waveguides and optical fibers, able to transport mid infrared radiation. Thus, the attenuation induced by these waveguides at 2.94 μm, as well as the changes in the temporal and spatial profile and the mechanical behavior of each one of them, were examined. Furthermore, in order to create an optical trap, which is not limited by the transmission characteristics of the observation system, in a simple and economical way, we developed a fiber optical trap. The fiber optical trap was integrated with a microbeam at 2.94 μm and the new system was tested on yeast cells and microspheres of PMMA. However, the new system encountered strong trapping difficulties, as now the objective lens is used only to observe the trapping and not to created it. Thus it becomes very difficult to focus the trapping beam at the lowest possible waist (~0.7μm). In this thesis, there was the need for detection of the laser microbeam at 2.94 μm and the optical trap beam at 1064 nm. The most widely the used detectors, for the detection of these specific wavelengths are the photon drag and the optical rectification detectors. The photon drag and optical rectification effects are results of radiation pressure and are presented as electric fields that can be measured, in semiconductors, such as germanium (Ge), silicon (Si), gallium arsenide (GaAs) and gallium phosphide (GaP), when appropriate electrical ohmic contacts have been made on them. We determined experimentally the coefficients of the photon drag and optical rectification effects in the semiconductors mentioned above. We found that the most efficient semiconductors for these wavelengths were Ge and GaP and they were mainly used as radiation detectors. On the contrary the semiconductor Si was not used as a detector, but was used only to develop a strong plasmonic optical tweezers. The simple optical trap has become a powerful and flexible tool for the micromanipulation of particles with size of some micrometers. However, restrictions are induced when the particle size is smaller than the wavelength of the laser trapping beam. To prevent escaping of a particle of a few nanometers from the trap, we developed an optical trap based on surface plasmons. Surface plasmons are electromagnetic modes that arise from the interaction between light and mobile surface charges, typically the conduction electrons in metals. We created a suitable substrate on which polystyrene particles of a few nanometers were trapped. The substrate was a silicon wafer, which has been irradiated with a laser microbeam, at 266 nm, to create on its surface, microstructures (spikes) of suitable geometry and periodicity. Then, we deposited on the microstructures a thin layer of silver (~80 nm). The presence of the silver on the surface of the microstructures, combined with the existence of surface plasmons, created an enhanced optical trap where the optical forces are a few nN (instead pN).