Δομική και Μοριακή Μελέτη Βιοκαταλυτών που εμπλέκονται στην Αποικοδόμηση της Ημικυτταρίνης

Abstract

Τα τοιχώματα των φυτικών κυττάρων αποτελούν την πιο άφθονη πηγή οργανικού άνθρακα στη γη και η αξιοποίησή τους σε βιοτεχνολογικές εφαρμογές έχει προσελκύσει τα τελευταία χρόνια έντονο ερευνητικό ενδιαφέρον. Τα ένζυμα που συμβάλλουν στην αποικοδόμηση της φυτικής βιομάζας παρουσιάζουν μεγάλο ενδιαφέρον λόγω της εφαρμογής τους σε πληθώρα διεργασιών όπως είναι η βιομηχανία χάρτου, η αρτοποιία, η υφαντουργία, η παραγωγή ζωωτροφών και απορρυπαντικών και η παραγωγή βιοαιθανόλης δεύτερης γενιάς, χρησιμοποιώντας ως πρώτη ύλη κυτταρινούχα φυτά, αγροτικά ή δασικά παραπροϊόντα ή ακόμα και απορρίματα. Ειδικότερα, οι ερευνητικές προσπάθειες των τελευταίων ετών έχουν στραφεί στη μείωση του ενζυμικού φορτίου και κατά συνέπεια του κόστους που απαιτείται για τη μετατροπή της βιομάζας σε ζυμώσιμα σάκχαρα ώστε να είναι εφικτή και συμφέρουσα η παραγωγή βιοαιθανόλης σε βιομηχανικό επίπεδο. Σκοπός της παρούσας διδακτορικής διατριβής ήταν η μελέτη βιοκαταλυτών που εμπλέκονται στην αποικοδόμηση της φυτικής βιομάζας με τη βοήθεια εργαλείων μοριακής και δομικής βιολογίας. Πιο συγκεκριμένα, χαρακτηρίστηκαν βιοχημικά δύο πρωτεΐνες της οικογένειας 61 της βάσης δεδομένων CAZy (Carbohydrate-Active enZYmes Database) και μελετήθηκαν κρυσταλλογραφικά δύο ένζυμα η δράση των οποίων ήταν ήδη γνωστή, μία ξυλανάση και μία εστεράση του φερουλικού οξέος. Αρχικά γίνεται μία ανασκόπηση της σύστασης του φυτικού κυτταρικού τοιχώματος και των ενζύμων που συμβάλλουν στην αποικοδόμησή του. Τα ένζυμα αυτά έχουν κατηγοριοποιηθεί σε οικογένειες ανάλογα με την αμινοξική τους αλληλουχία. Αναλύονται ειδικότερα οι ιδιότητες και τα χαρακτηριστικά των ενζύμων που ανήκουν στις οικογένειες των γλυκοζιδικών υδρολασών 61 και 10 της CAZy και που μελετήθηκαν στo πλαίσιo της παρούσας εργασίας. Παρουσιάζεται επίσης η μέθοδος της κρυσταλλογραφίας ακτίνων Χ ως εργαλείο για τη δομική μελέτη των μακρομορίων. Οι πρωτεΐνες της οικογενείας 61 που μελετήθηκαν προέρχονταν από τους μύκητες Fusarium oxysporum (FoCel61) και Sporotrichum thermophile (StCel61). Κλωνοποιήθηκαν και εκφράστηκαν μέσω της μεθυλότροφης ζύμης Pichia pastoris και χαρακτηρίστηκαν ως προς την ικανότητά τους να υδρολύουν μία ποικιλία σακχαρούχων υποστρωμάτων. Εξετάστηκε επίσης η συμβολή τους στην αποικοδόμηση της φυτικής βιομάζας παρουσία των κλασικών κυτταρινασών και συσχετίστηκε η παρατηρούμενη συνεργιστική δράση με τη σύσταση των χρησιμοποιούμενων υλικών. Βρέθηκε ότι τα ένζυμα αυτά έχουν την ικανότητα να αυξάνουν το βαθμό μετατροπής των λιγνινοκυτταρινούχων υποστρωμάτων όταν συνδυάζονται με τα γνωστά υδρολυτικά ένζυμα που χρησιμοποιούνται ευρέως στις διεργασίες αυτές και ότι η βελτίωση αυτή σχετίζεται με την περιεκτικότητα του υποστρώματος σε λιγνίνη. Η δομική μελέτη δύο ημικυτταρινασών που προέρχονται από το F. oxysporum, μίας ξυλανάσης της οικογένειας 10 (FoXyn10a) και μίας εστεράσης του φερουλικού οξέος τύπου C (FoFaeC) πραγματοποιήθηκε με κρυσταλλογραφία ακτίνων Χ. Κρύσταλλοι των δύο ενζύμων με ικανότητα περίθλασης των ακτίνων Χ αναπτύχθηκαν σε μία ποικιλία συνθηκών. Για τον προσδιορισμό της δομής της FoXyn10a εφαρμόστηκε η τεχνική της μοριακής αντικατάστασης χρησιμοποιώντας ως αρχικό μοντέλο τη δομή μίας ομόλογης ξυλανάσης από το Cellumonas fimi. Η καινούρια δομή ανέδειξε ότι η FoXyn10a υιοθετεί τη διαμόρφωση (β/α)8 barrel, μία αναδίπλωση κοινή σε όλα τα μέλη της οικογένειας 10, αλλά και την παρουσία ενός καινούριου βρόχου κοντά στην είσοδο του ενεργού κεντρού με πιθανό λειτουργικό ρόλο.

Plant cell walls are the most abundant source of organic carbon on the planet and their exploitation in biotechnological applications has attracted significant research interest. The enzymes implicated in plant biomass degradation are employed in a variety of industrial processes, ranging from paper, bread-making, textile, animal feed and detergent industry to the production of second generation bioethanol from cellulosic plants, agricultural and forestry byproducts or waste. Recent research efforts have focused on the reduction of protein loading required for the breakdown of lignocellulose to fermentable sugars, as the enzymic cost is currently the main obstacle of bioethanol production at industrial scale. The aim of the present PhD thesis was the biochemical and structural study of biocatalysts implicated in plant cell wall degradation. Two enzymes that belong to family glycoside hydrolase (GH) family 61 of CAZy (Carbohydrate-Active enZYmes) database were characterized biochemically while structural studies were carried out on a xylanase and a feruloyl esterase. In the first part of the thesis, the plant cell wall composition as well as the enzymes involved in its degradation are described. The latter have been divided into different families based on their amino acid sequence. The properties and characteristics of enzymes that belong to the GH families 61 and 10 of CAZy database are presented in more detail. The basic principles of X-ray crystallography, employed for the structural study of macromolecules, are also outlined. FoCel61, a Fusarium oxysporum GH61 and StCel61, a Sporotrichum thermophile GH61 were cloned and heterologously expressed in the methylotrophic yeast Pichia pastoris. Their ability to hydrolyze a variety of polysaccharide substrates was subsequently investigated. Synergism experiments were performed by combining these enzymes with common cellulases and the resulting findings were correlated to the composition of the hydrolyzed material. It was found that both enzymes had the ability to increase the degree of lignocellulose conversion when combined with other cellulases and that this enhancing effect was dependent on the lignin content of the substrate. The structural characterization of two hemicellulases derived from F. oxysporum, a GH10 xylanase (FoXyn10a) and a type C feruloyl esterase (FoFaeC) was performed by X-ray crystallography. Diffracting crystals of both enzymes were grown under a variety of conditions. The structure of FoXyn10a was solved by molecular replacement using an homologous Cellumonas fimi xylanase as a starting model. FoXyn10a folds in the classical (8 barrel (TIM barrel) while the most striking difference observed, upon comparison with related GH10 structures, is the presence of an elongated loop above the catalytic cleft with possible functional role.