Μελέτη των μορφολογικών χαρακτηριστικών ανθρωπίνων ερυθροκυττάρων συναρτήσει της θερμοκρασίας με μικροσκοπία ατομικής δύναμης

Abstract

Αντικείμενο της παρούσας διπλωματικής εργασίας είναι η μελέτη των μορφολογικών χαρακτηριστικών των ερυθρών αιμοσφαιρίων (ΕΑ) με την έκθεση αυτών σε διαφορετικές θερμοκρασίες φυσιολογικές (35 – 37 oC), ήπια μη φυσιολογικές (37 – 42 oC) και αφύσικα υψηλές (έως 510 oC) δεδομένου ότι επιδιώκουμε να εξετάσουμε σε in vitro συνθήκες την πιθανή τροποποίηση αυτών των χαρακτηριστικών σε εμπύρετη κατάσταση. Στο πείραμα χρησιμοποιήθηκε ως δείγμα, ολικό ανθρώπινο αίμα, το οποίο μπορούμε εύκολα να λάβουμε με μία προτυποποιημένη διαδικασία. Όγκος της τάξεως μερικών εκατοντάδων μl έως λίγα ml αίματος αρκεί για την εξέτασή του. Η μελέτη πραγματοποιήθηκε μέσω απεικονιστικών μεθόδων με Οπτικό Μικροσκόπιο (ΟΜ) και Μικροσκόπιο Ατομικής Δύναμης (ΜΑΔ). Για τη θέρμανση των υμενίων αίματος, κατασκευάστηκε αυτοσχέδια διάταξη θερμαινόμενου δειγματοφορέα που προσαρτήθηκε στη διάταξη του ΜΑΔ. Επάνω στο δειγματοφορέα αυτό, τοποθετείται το γυάλινο πλακίδιο με το υμένιο αίματος. Η πειραματική διάταξη χρησιμοποιήθηκε για θερμοκρασίες 20 – 90 oC. Εισαγωγικά in vitro πειράματα απέδειξαν ότι οι μεταβολές που υφίστανται τα ΕΑ τόσο σε μικροσκοπικό όσο και σε νανοσκοπικό επίπεδο στην συγκεκριμένη περιοχή θερμοκρασιών είναι πολύ μικρές. Σε μικροσκοπικό επίπεδο, στο δείγμα δύο υγιών δοτών, εξετάσαμε εύρος θερμοκρασιών 20 – 55 oC. Σημειώθηκε συνολική μεταβολή της τάξεως 2,24 – 3,81 % στη διάμετρο, 8,60 – 9,37 % στο ύψος και 5,41 – 6,79 % στο εμβαδόν. Σε νανοσκοπικό επίπεδο παρατηρήσαμε ότι συγκεκριμένες μορφολογικές δομές της μεμβράνης των ΕΑ διατηρούσαν αναλλοίωτα τα γεωμετρικά τους χαρακτηριστικά σε όλη την περιοχή αυτών των θερμοκρασιών.Η απόλυτη μορφολογική σταθερότητα των ΕΑ και της μεμβράνης τους σε θερμοκρασίες έως 90 oC μας διέγειρε το ενδιαφέρον και επεκτείναμε τη μελέτη μας σε σημαντικά υψηλότερες θερμοκρασίες, έως τους 510 oC, ακολουθώντας μια διαφορετική πειραματική διαδικασία. Αρχικά, μετρήσαμε με το ΜΑΔ υμένια αίματος που βρίσκονταν σε θερμοκρασία δωματίου, χρησιμοποιώντας τα ως δείγματα αναφοράς. Εν συνεχεία, θερμάναμε τα δείγματα στους 250, 300 αλλά και στους 400 oC σε έναν εργαστηριακό φούρνο. Κατόπιν, μετρήσαμε πάλι τα δείγματα αυτά και αξιολογήσαμε τόσο ποιοτικά όσο και ποσοτικά τα αριθμητικά αποτελέσματα. Η διάμετρος, το ύψος και το εμβαδόν των ΕΑ σαφώς σημείωσαν ραγδαία μείωση και τείνουν να εκμηδενιστούν στην περιοχή υψηλών θερμοκρασιών, αποδεικνύοντας ότι τα ΕΑ σε αυτές τις ακραίες θερμοκρασίες εξαχνώνονται. Τέλος, για εποπτική μελέτη, λάβαμε εικόνες στο ΟΜ από δείγματα που είχαν θερμανθεί σε θερμοκρασίες 400 – 510 oC. Στη θερμοκρασία των 510 oC, τα EA είχαν εξαχνωθεί πλήρως και έμειναν μόνο ίχνη που μαρτυρούν την ύπαρξή τους.

The purpose of this thesis is to study the morphological characteristics of red blood cells (RBC) after exposure on different temperatures, physiological (35-37 oC), mildly abnormal (37 - 42 oC) and abnormally high (up to 510 oC) as we examine the in vitro conditions indicate possible modification of these characteristics. The experiment used as sample human whole blood, easy to de obtained by a standardized process. Volume of the order of a few hundred μl to a few ml of blood is enough to examine. In particular, we studied the RBC’s, because both are much larger proportion in the blood compared with other cellular components and because they perform important biochemical processes one of which is the transfer of vital gases, such as oxygen, to the organs of the human body and the removal of toxic metabolic gases such as carbon dioxide. The study was conducted by imaging methods such as Optical Microscope (OM) and Atomic Force Microscope (AFM). Whereas the technique of OM is a familiar method in the field of Health Sciences, as applied to the study of biopsy material, the AFM began to apply in research recently in studies of specific cells and cellular components of blood. We complementary used both techniques during this study. Initially, the OM has the ability to examine blood cells on a scale of the order of mm - μm. Then, the AFM intensified observation scale of μm - nm. Another technical advantage of the AFM compared to the OM, is qualitative and quantitative results of digital information using appropriate software provided by the institution. Samples were suitable prepared for AFM study that requires uniform distribution of cellular components of blood. For this purpose, we performed the dilution process (initially normal hematocrit) of each donor’s blood, with a certain volume of autologous plasma in order to reduce hematocrit to the desired value. Then, the diluted blood overlaid on microscope glass slides using appropriate experimental setup to form monolayer RBC films. In this study, we chose this sample form to simulate the exact conditions in which hematologists and pathologists study blood cells in clinical practice. To heat the blood films, we constructed a homemade device of heating stage annexed to the configuration of the AFM. Above the heating stage, we placed the glass plate coated with blood. The device comprises: a) specially designed platform from Cu, b) wrapping by thread of high resistance. The selected material operated as resistor is Constantan and is used to increase the temperature of the stage, c) electric current source, d) digital thermometer. Giving appropriate values ​​to the intensity of electrical current, we can achieve the desired temperatures in the stage, and therefore temperature of the sample. With the lapse of 5-7 min, the digital thermometer’s indication got stabilized and then we began scanning a particulate area of the sample using the AFM. An important matter confront us, was the thermal homogenization of the surrounding area. Since RBC’s are not in a closed temperature-controlled chamber, but on a surface exposed to room temperature. To investigate the extent of thermal consistency of space above the surface of Cu stage, we held an introductory theoretical study by solving the heat diffusion differential equation using appropriate boundary conditions. Throughout the course of our experiments, the room was air-conditioned, which allows control of the boundary conditions of the problem. We used the experimental set described above for in situ heating at temperatures 20 - 90 oC. Introductory in vitro experiments showed that changes undergone by both RBC’s and on nanoscopic scale in this temperature range are very small. On microscopic scale, samples of two healthy donors examined at temperature range 20 - 55 oC. There was a total change of about 2.24 to 3.81 % in diameter, 8.60 to 9.37 % in height and 5.41 to 6.79 % in area. On nanoscopic scale, we observed that specific morphological structures of RBC membrane kept unchanged throughout the range of these temperatures. The rigid morphological stability of RBC’s and their membrane at temperatures up to 90 oC stimulated our interest and we extended our study to significantly higher temperatures, up to 510 oC, following a different experimental procedure. Initially, we measured the blood RBC films at room temperature, using as reference samples. Then, we heated the samples at 250, 300, 400 oC in a laboratory oven. Then, measured again these samples and assessed both qualitatively and quantitatively the numerical results. Diameter, height, and area of the RBC’s showed rapid decline indicating that they volatilize at these extreme temperatures. Finally, during supervisory study, we took images of the samples heated at temperatures 400 – 510 oC. At 510 oC, RBC’s had completely sublimed, leaving tracks that indicate their existence. The experimental conditions under of which in vitro this study conducted must be taken into account for proper interpretation of results. First, RBC’s were heated in the form of monolayer films and coated on glasslides in order to simulate the exact conditions under of which they are examined in clinical laboratories. Second, RBC’s were ex vivo heated, in atmospheric air, and not in their normal fluid environment (plasma).