Μελέτη του μηχανισμού βιομιμητικής σύνθεσης υδροξυαπατίτη παρουσία βιομορίων

Abstract

Στην παρούσα διπλωματική εργασία έγινε προσπάθεια μελέτης του μηχανισμού της αντίδρασης σύνθεσης βιοάλατος υδροξυαπατίτη με την χρήση υβριδικής τεχνικής απλής χημικής καταβύθισης, παρουσία βιοπολυμερών η οποία οδηγεί στην παραγωγή κολλοειδούς αιωρήματος και όχι ιζήματος υδροξυαπατίτη-βιομορίων. Το βιοάλας αυτό παρασκευάζεται για να χρησιμοποιηθεί στην παραγωγή εμφυτευμάτων τεχνητών οστών. Σκοπός της παρούσας εργασίας ήταν η μελέτη του μηχανισμού της αντίδρασης που ακολουθεί ο σχηματισμός βιοάλατος υδροξυαπατίτη από εξουδετέρωση υδροξειδίου του ασβεστίου με ορθοφωσφορικό οξύ, παρουσία βιομορίων χιτοζάνης ή κολλαγόνου σε περιβάλλον αργινίνης. Στην σύγχρονη έρευνα, έχει χρησιμοποιηθεί ποικιλία μεθόδων για την σύνθεση βιοκεραμικών αλάτων υδροξυαπατίτη, που προσεγγίζει σε μορφολογία την δομή του φυσικού οστού. Από τις σύγχρονες μεθόδους της έρευνας, η τεχνική του sol-gel αποτελεί την πιο πολλά υποσχόμενη, καθώς σαν μέθοδος επιτρέπει τον έλεγχο των παραγόμενων δομών και δεν είναι απαραίτητη η χρήση ακριβών εξοπλισμών ή υψηλών θερμοκρασιών. Η βιομιμητική προσέγγιση στην παρασκευή των βιοαλάτων που ακολουθήθηκε στα πλαίσια της παρούσας έρευνας, στοχεύει στην παραγωγή τελικού προϊόντος, που μιμείται καλύτερα τις ιδιότητες των οστών (δομή, αντοχές και βιοαποικοδομησιμότητα). Η χρησιμοποιούμενη τεχνική είναι μια υβριδική τεχνική, που συνδυάζει την μέθοδο της χημικής καταβύθισης με την sol-gel, καθώς το τελικό παραγόμενο προϊόν που προκύπτει δεν είναι ίζημα αλλά αιώρημα. Τα οφέλη της συγκεκριμένης υβριδικής τεχνικής έγκεινται, στην παραγωγή ελεγχόμενων δομών που προσεγγίζουν την δομή του βιοαπατίτη των οστών, με χρήση σχετικά απλών αντιδραστηρίων, στην ευκολότερη και οικονομικότερη παραγωγή προϊόντος σε σύγκριση με άλλες μεθόδους, όπως η υδροθερμική και στην παραγωγή τελικού βιοσυμβατού προϊόντος. Ο κύριος πειραματικός όγκος της παρούσας διπλωματικής περιλαμβάνει την παραγωγή αιωρημάτων υδροξυαπατίτη και στην συνέχεια σκονών παρασκευασμένων ώστε να αντιπροσωπεύουν ενδιάμεσα στάδια της αντίδρασης, κατά τα οποία έχουν προστεθεί στο διάλυμα διάφορα ποσοστά των αντιδρώντων. Τα αιωρήματα και οι σκόνες παρήχθησαν σε συνδυασμό δύο διαφορετικών βιομορίων-υλικών αποτύπωσης (κολλαγόνο και χιτοζάνη), προκατεργασμένων στο αντιδρόν οξύ, και δύο διαφορετικών αναλογιών ιόντων των αντιδρώντων Ca/P στο τελικό διάλυμα (1/1 και 10/6), υπό συνθήκες περίσσειας και μη ιόντων φωσφορικού οξέος κατά την αντίδραση. Η αντίδραση έλαβε χώρα σε περιβάλλον αργινίνης. Τα αιωρήματα που παρήχθησαν μελετήθηκαν ως προς το pH και την μεταβολή του κατά την αντίδραση σχηματισμού υδροξυαπατίτη, το ιξώδες και την επιφανειακή τάση των τελικών αιωρημάτων. Mελετήθηκε ακόμα η μεταβολή του ζ-δυναμικού κατά την διάρκεια της αντίδρασης, για την περίπτωση υδροξυαπατίτη που παρήχθη παρουσία χιτοζάνης υπό συνθήκες περίσσειας οξέος. Oι παραγόμενες σκόνες χαρακτηρίστηκαν με τεχνικές FT-IR, XRD, Raman και ΤΕΜ. Στα αρχικά αιωρήματα οξέων-βιομορίων, έγινε μελέτη της μεταβολής του ιξώδους και επιβεβαιώθηκε η σταθεροποίηση των αιωρημάτων μετά από δύο ώρες ανάδευσης. Μετά από την επεξεργασία των αποτελεσμάτων, έγινε προσπάθεια καθορισμού της βασικής αλληλουχίας σταδίων της αντίδρασης και παρατήρησης του τρόπου με τον οποίο επιδρούν τα διαφορετικά βιομόρια στην σύνθεση του υδροξυαπατίτη. Στα πλαίσια της μελέτης του μηχανισμού της αντίδρασης, επιβεβαιώθηκε η παραγωγή προϊόντων νανοράβδων παρεμφερών διαστάσεων (από 53nm έως 17,5nm μήκος) για κάθε εξεταζόμενη περίπτωση. Ανιχνεύθηκαν δευτερεύουσες ανθρακικές φάσεις κατά προτίμηση στα δείγματα που συντέθηκαν παρουσία χιτοζάνης, αποδείχθηκε ότι ο σχηματισμός υδροξυαπατίτη έχει ξεκινήσει από την προσθήκη του 10% των συνολικών αντιδραστηρίων. Δεν προέκυψαν ανιχνεύσιμες διαφοροποιήσεις στα προϊόντα πριν και μετά την γήρανση. Το σύνολο των ανωτέρω στοιχείων μπορεί να οδηγήσει στο συμπέρασμα ότι η αντίδραση ακολουθεί, για κάθε μια από τις μελετώμενες τέσσερις περιπτώσεις, κοινό μηχανισμό. Ο μηχανισμός φάνηκε να επηρεάζεται από α) την ύπαρξη περίσσειας ή όχι οξέος (μεγαλύτεροι νανοράβδοι παράγονται παρουσία περίσσειας σε δείγματα παραγόμενα με ίδιο συνδυασμό βιομορίων), και β) από το είδος του βιομορίου - υλικού αποτύπωσης ( καλύτερα κρυσταλλωμένο το προϊόν που παρήχθη παρουσία υδροξυαπατίτη, όπως φάνηκε από τα αποτελέσματα του XRD και TEM)

Controlling the formation and structure of hydroxyapatite nanorods is vital for the achievement of a consistent product. This is especially difficult in bioinspired and biomimetic systems where, in addition to chemical reaction parameters, the process of the reaction may be influenced by the presence of biomolecules. For a better understanding of the reaction mechanism that takes place during the synthesis of hydroxyapatite in the presence of biomolecules such as L-Arginine, Collagen and Chitosan, four different cases of hydroxyapatite synthesis were investigated at intermediate stages during the reaction so that the presence of secondary or precursor phases could be determined and the process of the reaction revealed. In the investigated systems the reaction between Η3ΡΟ4 and Ca(OH)2 took place in the presence of Collagen or Chitosan and L-Arginine for two different molar ratios of Ca2+/P 1/1 and 10/6 in basic pH conditions and biomimetic temperature (40ο). The resulting products after ageing were dried and characterized by Transmission Electron Microscopy, Fourier Transformation Infrared Spectroscopy, X-Ray Diffraction and Raman Spectroscopy. The analysis showed that in all cases, hydroxyapatite nanorodes were produced from an early stage of the reaction and that no preliminary phases such as ACP and OCP were detected. Some results indicated the presence of carbonated salts and possibly calcium deficient apatite as secondary phases. This mechanism is common for all cases studied, though the presence of secondary phases was more clearly indicated in Hap-Chit and 10/6 Ca/P Molar ratio. The sample that demonstrated the best characteristics in terms of suspension stability and nanorod size without favoring the formation of secondary phases during its synthesis, was that of hydroxyaptite bioceramic produced in the presence of Collagen for molar ratio of Ca2+/P 1/1.