Μοντελοποίηση και βελτιστοποίηση θορύβου σε πολυπλεκτικά πειράματα ELISA

Abstract

Αποτελέσματα υψηλής απόδοσης και πολυπλεξίας είναι απαραίτητες προϋπο¬θέσεις για την μοντελοποίηση πολύπλοκων βιολογικών συστημάτων. Οι 2 αυτοί στόχοι συνήθως είναι αντικρουόμενοι και ο συνδυασμός του απαιτεί την χρήση μοντέλων βελτιστοποίησης. Τα μοντέλα που αναπτύχθηκαν χρησιμοποιούν κατάλληλου τύπου δεδομένα τα οποία παρήχθησαν στο εργαστήριο,με αποτέλεσμα νααναπαριστούν τα διάφορα ήδη θορύβου, σε συνδυασμό με αλγόριθμους για την επιλογή των βέλτιστων σημάτων,έτσι ώστε να περιορίζεται, κατά το δυνατόν, ο πολλαπλασιασμός του θορύβου. Η μέθοδος που αναπτύχθηκε, σε αντίθεση με τις παραδοσιακές προσέγγισης, ελέγχει το σύνολο των πιθανών συνδυασμών και επιλέγει τον συνδυασμό ο οποίος ελαχιστοποιεί τα σφάλματα τύπου Ι. Για την δοκιμή της μεθόδου υπολογίστηκε το καλύτερο πείραμα από ένα σύνολο 80 σημάτων για το οποίο καταφέραμε να μειώσουμε το θόρυβο πάνω από 80% και να υπερδεκαπλασιάσουμε το λόγο σήματος θορύβου περιορίζοντας τον αριθμό των σημάτων στα 56. Στόχος είναι με τα δεδομένα της ανάλυσης να μπορέσουμε να κάνουμε μια μετά-ανάλυση, ώστε να κατηγοριοποιήσουμε τα αντισώματα που χρησιμοποιούμε βάση της ιδιότητας τους να αλληλεπιδρούν μεταξύ τους και να παράγουν θόρυβο.

High-throughput multiplexed assays are becoming popular tools for constructing high quality proteomic datasets, which are essential for computational models in Systems Biology. xMAP technology (Luminex, Austin, TX) combines the advantages of high-throughput and high-density, giving the ability to perform multiplexed assays with up to 500 proteins per sample, using sample volumes of 50μl or less. Despite their high potential for multiplexability, xMAP panels currently do not measure more than 50 distinct proteins. To increase the current capacity, two main limitations must be overcome: i) the numerous off-target reactions of an antibody, and ii) the diversity of analyte concentrations in an assay. To tackle these issues, we employed a combined computational and experimental approach to i) build optimal multiplexed assays with minimal noise, ii) identify antibodies of poor quality, and iii) tune the individual assays so the fluorescent intensity falls within the linear range of the Luminex’ detection system. As a case study, we optimized an 80-plex cytokine panel for measuring secreted proteins. The 80plex performance was benchmarked via a Leave-One- Target-In (LOTI) analysis and a Leave-One-Detection-In (LODI) analysis. Dilution curves on detection antibodies where also performed (IC50 curves). Background noise was measured by the LODI assay where no samples were added and every “sandwich” scheme formed was between the single detection antibody and one of the (80) capture antibodies. Cross reactions were identified through the LOTI assay where only a single sandwich scheme is expected to be formed. In both assays, results indicating to off-target effects were observed. Two computational schemes were developed. Firstly, IC50 curves were used to tune the assays to the sample concentration and to increase the signal intensity without significant increase of noise. Secondly, an optimization algorithm was employed to select the least “noisy” pairs and identify the “dirtiness” of each antibody. Our approach, in contrast to traditional assay development, highlights the importance of a top-down strategy where dozens of assays are multiplexed and compared simultaneously. Apart from describing an optimal assay, our method also provides a list of features for every antibody that defines its behavior, allowing us perpetual improvement of the xMAP panels’ sensitivity, specificity, and multiplexability.