Βαθμονόμηση οπτικής παγίδας μέσω διηλεκτροφόρησης και μέτρηση ελαστικών ιδιοτήτων σε λιποσώματα

Abstract

Τα λιποσώματα είναι κολλοειδή σωματίδια αποτελούμενα από μια ή περισσότερες φωσφολιπιδικές διπλοστοιβάδες, οι οποίες περικλείουν στο εσωτερικό τους ένα υδάτινο διάλυμα. Λόγω των ιδιοτήτων της μεμβράνης τους, αποτελούν ένα ιδανικό κυτταρικό μοντέλο, αλλά επίσης και το κύριο συστατικό προηγμένων συστημάτων μεταφοράς φαρμακευτικών ουσιών. Σημαντικό ρόλο στη συμπεριφορά τους, όσον αφορά τις παραπάνω λειτουργίες, έχουν οι μηχανικές ιδιότητες των λιπιδικών μεμβρανών. Σε αυτήν την εργασία μελετήθηκαν λιποσώματα από λεκιθίνη αυγού χρωσμένα με μπλε του μεθυλενίου, και μετρήθηκε το μέτρο διάτμησης και το μέτρο κάμψης τους με την τεχνική της οπτικής παγίδας γραμμής. Για την επίτευξη της οπτικής παγίδας χρησιμοποιήθηκε ένα διοδικό laser με μήκος κύματος εκπομπής στα 660 nm και ένα ανάστροφο μικροσκόπιο με αντικειμενικό φακό αριθμητικού ανοίγματος NA=1,25 και μεγέθυνσης 100X. Στη διάταξη της συμβατικής οπτικής παγίδας τοποθετήθηκαν δυο κυλινδρικοί φακοί, πριν την είσοδο της δέσμης στον αντικειμενικό φακό, μετατρέποντας έτσι τη συμβατική οπτική παγίδα σε οπτική παγίδα γραμμής (Line Optical Tweezers). Με την τεχνική αυτή, η δέσμη εστιάζεται σε μια μόνο διάσταση και, λόγω αυτού του προφίλ, τα λιποσώματα υπόκεινται σε μετασχηματισμούς της μεμβράνης τους και σε αντιστρεπτές παραμορφώσεις. Για τη μέτρηση των οπτικών δυνάμεων που ασκούνται στα λιποσώματα, χρησιμοποιήθηκε η μέθοδος της διηλεκτροφόρησης. Με δυο επίπεδα μικρο-ηλεκτρόδια, τοποθετημένα στο πλακίδιο όπου μελετάται το δείγμα, εφαρμόζεται εναλλασσόμενη τάση στα ήδη παγιδευμένα λιποσώματα εως ότου αυτά διαφύγουν της παγίδας. Με αυτόν τον τρόπο μετρήθηκαν οι οπτικές δυνάμεις σε λιποσώματα διαμέτρου 850 και 1250 nm για διάφορες τιμές της ισχύος του laser και προσδιορίστηκε η αποδοτικότητα της συμβατικής οπτικής παγίδας. Επίσης μετρήθηκε η αποδοτικότητα της οπτικής παγίδας γραμμής για λιποσώματα με διάμετρο 3 μm. Παρόλο που η αποδοτικότητα και στις δυο περιπτώσεις ήταν σχετικά χαμηλή σε σχέση με άλλες αναφορές, οι οπτικές δυνάμεις που προέκυψαν ήταν αρκετά ισχυρές για την σταθερή παγίδευση λιποσωμάτων μικρότερων του ενός μικρομέτρου ή για την παραμόρφωση λιποσωμάτων διαμέτρων 4 και 5 μm. Γνωρίζοντας, με τον παραπάνω τρόπο, τις δυνάμεις που προκαλούν τις ελαστικές παραμορφώσεις στα λιποσώματα, και προσδιορίζοντας τη μεταβολή των διαστάσεών τους με το λογισμικό του μικροσκοπίου, χρησιμοποιήθηκαν κάποια μηχανικά μοντέλα για τον υπολογισμό του μέτρου διάτμησης και του μέτρου ακαμψίας τους. Οι τιμές που προέκυψαν για το μέτρο κάμψης κυμαίνονται στην ίδια τάξη μεγέθους με αυτές που αναφέρονται στην βιβλιογραφία για λιποσώματα σε gel φάση, ενώ αυτές για το μέτρο διάτμησης είναι σχετικά χαμηλές, αλλά οι αναφορές σε σχετικές μετρήσεις είναι περιορισμένες. Επιπλέον μετρήθηκε η ελαστικότητα των λιποσωμάτων με μπλε του μεθυλενίου διαμέτρου 1-2 μm, μέσω της τεχνικής της μικροσκοπίας ατομικών δυνάμεων, ως μια προσπάθεια για το συνδυασμό των αποτελεσμάτων με αυτά της οπτικής παγίδας γραμμής. Παρατηρήθηκε πως οι τιμές του μέτρου κάμψης που προέκυψαν από τις μετρήσεις μέσω της μικροσκοπίας ατομικών δυνάμεων ήταν χαμηλότερες από τις τιμές που υπολογίστηκαν με τη μέθοδο της οπτικής παγίδας γραμμής. Αντίστοιχα αποτελέσματα έχουν αναφερθεί και αλλού στη σχετική βιβλιογραφία. Τέλος, μελετήθηκε η ελαστικότητα λιποσωμάτων διαφόρων συνθέσεων, όπως και άλλα με την ενσωμάτωση σε αυτά υπερδιακλαδικών πολυμερών δεύτερης γενιάς. Από τα αποτελέσματα φαίνεται ότι η προσθήκη τέτοιων πολυμερών συντελεί στην αύξηση του μέτρου ελαστικότητας των λιποσωμάτων.

Liposomes are colloidal particles consisting of one or more phospholipid bilayers witch enclose an aqueous solution. Due to the properties of their membranes, they consist an ideal cell model, and as well the main component of advanced drug delivery systems. The mechanical properties of their membranes play an important role in their behavior as such systems. In this dissertation we studied liposomes from egg lecithine stained with methylene blue and we measured their shear and bending modulus, using Line Optical Tweezers. A diode laser emitting at a wavelength of 660 nm and an inverted microscope with objective lens of numerical aperture NA = 1.25 and magnification 100X, were used in order to achieve the optical trap system. By adding two cylindrical lenses before the laser entrance to the objective lens, the conventional optical trap was converted to a line optical trap system. This way the laser output is focused in a single dimension, thus the liposomes are subject to transformations of their membranes and to reversible deformations. In order to calculate the optical forces acting on liposomes, the method of dielectrophoresis was used. By means of two planar microelctrodes, placed on the sample plate, alternating voltage was applied in the trapped liposomes, until they escape the optical trap. Optical forces on liposomes of 850 and 1250 nm diameters were measured for different laser power values, and the conventional optical trap efficiency was calculated. Moreover, the efficiency of the line optical trap was measured for liposomes with diameter of 3 μm. Despite the fact that both values of the trapping efficiencies were low in regard to other references, the optical forces obtained were strong enough to achieve stable trapping of liposomes smaller than one micrometer, or to induce deformation of liposomes with diameters of 4 and 5 μm. With the optical forces specified as above, and determining the change in the dimensions of the liposomes by the optical microscope’s software, some mechanical models were used in order to calculate the shear and bending modulus. The values obtained for the bending modulus are in the range of the values reported elsewhere for liposomes in gel phase, while the shear modulus values measured are relatively low, while references to relevant measurements are limited. Moreover, the Young modulus of liposomes stained with methylene blue, with diameters of 1-2 μm, was measured by the method of atomic force microscopy (AFM), as an attempt for the combination of both results from AFM and Line Optical Tweezers. It was observed that the values of bending modulus obtained by the AFM measurements were lower than those obtained with the Line Optical Tweezers. Similar results have also been reported elsewhere in the literature. Finally, it was also measured the elasticity of liposomes of different kind of compartments, as well as others incorporating hyperbranched polymers of second generation. According to the results, it seems that the addition of such polymers tend to increase the Young modulus of the liposomes.