Μελέτη της ζύμης LIPOMYCES STARKEYI ως προς την ικανότητα βιοσύνθεσης ενδοκυτταρικού λίπους σε συνθετικά υποστρώματα και ρευστοποιημένα στελέχη γλυκκού σόργου

Abstract

Η μεγάλη ζήτηση σε ενέργεια, η παγκόσμια αύξηση της θερμοκρασίας η οποία οφείλεται στις εκπομπές των αερίων του θερμοκηπίου, η μόλυνση του περιβάλλοντος, η αύξηση της τιμής του αργού πετρελαίου και η γρήγορη μείωση της προσφοράς ορυκτών καυσίμων είναι οι βασικοί παράγοντες που οδήγησαν στην αναζήτηση εναλλακτικών πηγών ενέργειας. Μία μορφή εναλλακτικής πηγής ενέργειας αποτελεί το βιοντίζελ, το οποίο προέρχεται από διάφορα φυτικά ελαία, ζωικά λίπη, καθώς και απόβλητα ελαίων. Ως εναλλακτική λύση των γεωργικών και ζωικών πηγών για την παραγωγή ελαίων και λιπών, έχουν θεωρηθεί οι μικροοργανισμοί. Υπάρχουν πολλές ζύμες και μύκητες, καλούμενοι ελαιογόνοι μικροοργανισμοί, οι οποίοι μπορούν να συσσωρεύουν ενδοκυτταρικά υψηλές ποσότητες μικροβιακού λίπους (SCO), το οποίο έχει την ίδια σύνθεση λιπαρών οξέων με τα φυτικά έλαια. Συνεπώς, η παραγωγή βιοντίζελ από ελαιογόνους μικροοργανισμούς αποτελεί μια πολλά υποσχόμενη εναλλακτική λύση. Η παρούσα ερευνητική μελέτη, είχε στόχο τη διερεύνηση της βιοφυσιολογικής συμπεριφοράς της ζύμης Lipomyces starkeyi και της ικανότητάς της να συσσωρεύει ενδοκυτταρικό λίπος. Για το σκοπό αυτό, πραγματοποιήθηκαν τέσσερις σειρές πειραμάτων μεταβάλλοντας κάθε φορά από μία παράμετρο. Πιο συγκεκριμένα η πρώτη σειρά πειραμάτων αφορούσε την ικανότητα ανάπτυξης και παραγωγής λίπους της εν λόγω ζύμης καταναλώνοντας τα σάκχαρα που υπάρχουν στο γλυκό σόργο (δηλαδή σακχαρόζη, γλυκόζη και φρουκτόζη) σε αρχική συγκέντρωση 40g/L, ενώ ο λόγος C/N ήταν ίσος με 100. Όλες οι ζυμώσεις που πραγματοποιήθηκαν ήταν ασυνεχούς τύπου σε ανακινούμενο επωαστήρα. Τα αποτελέσματα έδειξαν ότι το γλυκό σόργο θα μπορούσε να αποτελέσει κατάλληλο υπόστρωμα για την ανάπτυξη της ζύμης L. starkeyi και την παραγωγή λίπους. Στη συνέχεια έγινε έλεγχος της πηγής αζώτου. Χρησιμοποιήθηκαν οργανικές πηγές αζώτου: ουρία, πεπτόνη και yeast extract και ανόργανες: χλωριούχο αμμώνιο (NH4Cl), θειικό αμμώνιο ((NH4)2SO4) και όξινο φωσφορικό αμμώνιο (NH4)2HPO4. Ως πηγή άνθρακα χρησιμοποιήθηκε μίγμα σακχαρόζης, γλυκόζης και φρουκτόζης με αρχική συγκέντρωση 40g/L και ο λόγος C/Ν ήταν 100. Τις καλύτερες αποδόσεις σε παραγωγή ενδοκυτταρικού λίπους έδωσε η πεπτόνη με 44,02% w/w και το yeast extract με 43,70% w/w, ενώ οι συγκεντρώσεις λίπους έφθασαν την τελευταία ημέρα της ζύμωσης τα 4,86 g/L και 5,23 g/L αντίστοιχα. Στην τρίτη σειρά πειραμάτων έγινε έλεγχος για την εύρεση της επίδρασης του λόγου άνθρακα/αζώτου στην ανάπτυξη και ικανότητα βιοσύνθεσης ενδοκυτταρικού λίπους από τη ζύμη L. Starkeyi. Τα πειράματα που διεξήχθηκαν είχαν λόγο άνθρακα/αζώτου 130, 160, 190, 220 και τέλος 250. Ως πηγή αζώτου χρησιμοποιήθηκε το yeast extract, το οποίο έδωσε τα καλύτερα αποτελέσματα, με βάση τη δεύτερη σειρά πειραμάτων, ενώ πηγή σακχάρων αποτέλεσε το μίγμα σακχαρόζης, γλυκόζης και φρουκτόζης με αρχική συγκέντρωση 40g/L. Ο βέλτιστος λόγος C/N για την παραγωγή ενδοκυτταρικού λίπους ήταν ο 190 με μέγιστη παραγωγή λίπους στα 5,81g/L και έναν συντελεστή παραγωγής λίπους ίσο με 47,33% w/w. ~ 2 ~ Παρατηρήθηκε ότι με την αύξηση του λόγου C/N, υπήρχε μια σταδιακή αύξηση της % συγκέντρωσης του ενδοκυτταρικού λίπους σε σχέση με την συνολική ξηρή βιομάζα, έως της τιμής C/N 190, ενώ από εκεί και έπειτα με την αύξηση της αναλογίας του άνθρακα, παρατηρείται μια μικρή μείωση της % συγκέντρωσης λίπους. Ωστόσο οι διαφορές δεν είναι πολύ μεγάλες και έτσι φαίνεται ότι η ζύμη έχει την ικανότητα να συσσωρεύει σημαντικές ποσότητες λίπους σε ένα σημαντικό εύρος τιμών του λόγου C/N (από 100 έως και 220). Τέλος, μετά την διερεύνηση των συνθηκών που επηρεάζουν την ανάπτυξη της ζύμης L. starkeyi και την ικανότητα συσσώρευσης ενδοκυτταρικού λίπους, πραγματοποιήθηκε ανάπτυξη της ζύμης σε ρευστοποιημένο γλυκό σόργο, όπου έγινε έλεγχος της ικανότητας της ζύμης να καταναλώνει ταυτόχρονα και το άζωτο που περιέχετε στο σόργο με την μορφή πρωτεϊνών.

The great demand for energy, the global warming which is caused from the emission of greenhouse gases, the environmental pollution, the rising price of the crude oil and the rapid decrease of the supply of fossil fuels are the prime factors that have increased the interest for the production of fuels from renewable resources. Biodiesel comprise one form of renewable energy, which can be produced by utilizing as raw material various vegetable oils, animal fats, as well as oil wastes. Apart from the agricultural and animal sources, microorganisms are considered an alternative solution for the production of oil lipids which could be utilized as raw material for the production of biodiesel. There are plentiful yeasts and fungi, called oleaginous microorganisms, which are capable of accumulating high quantities of microbial lipid (SCO – single cell oil), which has the same composition of fatty acids with vegetable oils. As a result, the utilization of yeast for the production of biodiesel seems to be promising. The aim of this study is to investigate the biophysical behavior of the yeast Lipomyces starkeyi and its ability to accumulate intracellular lipid. For this purpose, four series of experiments were performed, changing each time one of the parameters. More specifically, during the first series of experiments the ability of the yeast to grown and accumulate intracellular lipids, when cultivating on the sugars present in sweet sorghum (namely sucrose, glucose, fructose and a mixture of them) was evaluated. Initial sugar concentration was adjust of 40g/L, while the C/N ratio was equal to 100. Batch cultivations were carried out at a rotary shaker. The results have shown that the sweet sorghum is a proper substrate for the cultivation of the yeast in order to accumulate SCO. Subsequently, the effect of the nitrogen source was evaluated. Both organic and inorganic sources were tested. More specifically organic sources of nitrogen were: urea, peptone and yeast extract, and the inorganic were: ammonium chloride (NH4Cl), ammonium sulphate ((NH4)2SO4) and diammonium phosphate (NH4)2HPO4. The carbon source that was used was a mixture of sucrose, glucose and fructose at an initial concentration of 40g/L, while the C/N ratio was equal to 100. The best results for the production of intracellular lipid were obtained when peptone and yeast extract were used, giving a yield of 44,02% w/w and 43,70% w/w respectively. Concentration of SCO reached 4,86 g/L and 5,23 g/L respectively. At the third series of experiments, the effect of the carbon to nitrogen ratio (C/N) on yeast growth and SCO accumulation ability was examined. During these experiments, the C/N ratios examined, were 130, 160, 190, 220 and 250. Yeast extract was utilized as nitrogen source (based on previous results) while the mixture of sucrose, glucose and fructose at an initial concentration of 40g/L was used as carbon source. The optimum C/N ratio for the production of intracellular lipid was found to be 190, where a production of 5,81g/L SCO and a lipid production coefficient that is equal to 47,33% w/w were obtained. It was observed that with increasing C/N ratio up to 190, a gradual increase of % w/w lipid concentration was obtained while from this point on with the increase of the proportion of the carbon, a small reduction of the % lipid concentration was observed. Nevertheless, due to the fact that at these range of C/N ratios, differences concerning SCO accumulation were not very important, indicating that the yeast is capable of producing significant amounts of SCO at a wide range of C:N ratios (from 100 up to 220). Eventually, after the investigation of the conditions that affect the growth and SCO accumulation of L. starkeyi when cultivated on synthetic media, the ability of the yeast to grow on liquefied sweet sorghum stalks was examined. During this experiment, no external nitrogen source was added, in order to evaluate the ability of the yeast to utilize the proteins contained in sweet sorghum.