Ανάπτυξη τρισδιάστατων ικριωμάτων υδροξυαπατίτη/βιοπολυμερών

Abstract

Κατά την πάροδο των τελευταίων, κυρίως, ετών, η πρόοδος των ιατρικών επιστημών έχει συμβάλλει σημαντικά στην αύξηση του προσδόκιμου ορίου επιβίωσης. Ως εκ τούτου, η ανάπτυξη και χρήση των βιοϋλικών ως υποκατάστατων ζωτικών τμημάτων του ανθρωπίνου οργανισμού εξελίσσεται με ταχύ ρυθμό, για τη διασφάλιση της υγείας και της ποιότητας ζωής. Τα βιοϋλικά, φυσικά ή τεχνητά, πρέπει να αποκαθιστούν τη λειτουργία των οργάνων ή ιστών εντός των οποίων τοποθετούνται, χωρίς να προκαλούν ανεπιθύμητες παρενέργειες. Μία από τις σημαντικότερες εφαρμογές των βιοϋλικών, είναι η κατασκευή ικριωμάτων ιστών, τα οποία δημιουργούν το κατάλληλο περιβάλλον για την καθοδήγηση του νέου ιστού, την υποστήριξη της ανάπτυξής του, την εξάπλωση και τη διαφοροποίηση εμφυτευμένων κυττάρων. Τα ικριώματα αυτά, προσφέρουν μια μηχανικά σταθερή και πορώδη δομή, που επιτρέπει στα κύτταρα να μεταναστεύσουν μέσα στο περιβάλλον και έτσι να προωθήσουν την ανακατασκευή του ιστού, τόσο μέσα στον οργανισμό όσο και σε τεχνητό περιβάλλον. Η λειτουργικότητα του κατασκευασμένου ικριώματος εξαρτάται από πολλούς παράγοντες, οι οποίοι καθορίζουν σε ποιο βαθμό το ικρίωμα μπορεί να μιμηθεί τα χαρακτηριστικά του φυσικού εξωκυτταρικού δικτύου. Καθώς είναι γνωστό ότι πολλά λειτουργικά μόρια, υλικά εξωκυτταρικών δικτύων και κύτταρα αλληλεπιδρούν ιδιαιτέρως σε κλίμακα μεγέθους νανομέτρων, είναι σαφές πως μεγάλη σημασία για την επιτυχή δημιουργία ικριωμάτων έχει η κατασκευή κατάλληλων τρισδιάστατων δομών στη νανοκλίμακα. Στόχος της παρούσας εργασίας είναι η κατασκευή τρισδιάστατων ικριωμάτων υδροξυαπατίτη παρουσία των βιομορίων κολλαγόνου ή χιτοζάνης και L-αργινίνης, με επιθυμητό πορώδες, μέγεθος πόρων και μηχανικών ιδιοτήτων, που θα ευνοήσουν την ανάπτυξη νέου οστικού ιστού. Καθώς η ύπαρξη πόρων οδηγεί σε μείωση της μηχανικής αντοχής των ικριωμάτων, γίνεται χρήση των διασυνδετών γλουταραδλεΰδης και γενιπίνης, ώστε να αυξηθεί η σταθερότητα, η ελαστικότητα, και η σκληρότητα των πρώτων. Η περιεκτικότητα της γλουταραλδεΰδης στο αιώρημα του υδροξυαπατίτη λαμβάνει τις τιμές 0.8, 1.7 και 2.5% επί του βιοπολυμερούς, χιτοζάνη ή κολλαγόνο, και η γενιπίνη προστίθεται σε αναλογία μαζών 100/2 (βιοπολυμερές/γενιπίνη). Τα ικριώματα παράγονται με τη μέθοδο της λυοφιλίωσης (freeze drying), όπου εξετάζονται διαφορετικοί ρυθμοί ψύξης και εξάχνωσης του υλικού. Ο ρυθμός ψύξης μπορεί να είναι αργός (αρχικά -5οC και ύστερα -55οC), ενδιάμεσος (-55οC), ή ταχύς (-196οC), ενώ ο ρυθμός εξάχνωσης ρυθμίζεται με τη μεταβολή της πίεσης εντός του θαλάμου λυοφιλίωσης, η οποία λαμβάνει τις τιμές 0.1, 0.35 και 0.7mbar. Τα παραχθέντα ικριώματα χαρακτηρίζονται ως προς την κρυσταλλικότητά τους, τη μορφολογία τους και τις μηχανικές ιδιότητές τους με τις τεχνικές περίθλασης ακτίνων Χ (XRD), φασματομετρίας υπερύθρου με μετασχηματισμό Fourier (FTIR), ηλεκτρονικής μικροσκοπίας σάρωσης (SEM) και υπολογιστικής τομογραφίας ακτίνων Χ (CT). Αναφορικά με τη χρήση διασυνδέτη, η βέλτιστη περιεκτικότητα γλουταραλδεΰδης αποδείχθηκε πως είναι 1.7%, δίχως να εμφανίζει τοξικότητα, οδηγώντας σε ικανοποιητικό ποσοστό μικροπορώδους και μακροπορώδους δικτύου. Η γενιπίνη, παρ’ όλο που ως φυσικός διασυνδέτης εμφανίζει πολύ χαμηλότερη τοξικότητα, παρουσιάζει το μειονέκτημα πως τα ικριώματα χάνουν τη συνεκτικότητά τους εντός υδατικού διαλύματος σε λιγότερο από 24 ώρες. Βέλτιστες τιμές ρυθμού ψύξης και εξάχνωσης είναι αντίστοιχα αυτές των -55οC και 0.35mbar, όπου τα ικριώματα παρουσιάζουν μακροπορώδες και μικροπορώδες δίκτυο, με μέγεθος μακροπόρων έως 100μm και μικροπόρων περίπου 10μm, και ικανοποιητική μηχανική αντοχή.

Over the past few decades, advances in medical sciences have contributed significantly to the increase in life expectancy. Therefore, the development as well as the use of biomaterials as substitutes of vital parts of the human body progress rapidly, so as to ensure one’s health and quality of life. Biomaterials, either natural or synthetic, have to restore the normal function of the organs or tissues into which they are inserted, without causing undesirable side effects. An application of biomaterials, which is of utmost importance, is the manufacture of tissue scaffolds, which provide a suitable environment for the conduction and formation of the new tissue, as well as the proliferation and differentiation of implanted cells. These scaffolds offer a mechanically stable and porous structure that allows cells to migrate into its environment, promoting, hence, the reconstruction of the tissue, both in vivo and in vitro. The functionality of the fabricated scaffolds depends on several factors which determine to what extent the scaffold can mimic the characteristics of the natural extracellular network. Since it is known that many functional molecules, extracellular network materials and cells interact especially in the nanoscale, it is apparent that the construction of three-dimensional nanostructures plays a crucial role for the successful manufacturing of scaffolds. The aim of the present work is the fabrication of three-dimensional hydroxyapatite scaffolds in the presence of the biomolecules collagen or chitosan and L-arginine, presenting the desired porosity, pore size and mechanical properties in order to support the formation of new bone tissue. Since porosity generally reduces scaffold strength, the use of the cross-linkers glutaraldehyde and genipin is regarded as necessary, so as to increase the scaffold stability, elasticity and hardness. The content of glutaraldehyde in the hydroxyapatite suspension takes the values 0.8, 1.7 and 2.5%wt in respect of the biopolymer content, collagen or chitosan, whereas genipin is added based on the weight ratio 100/2 (biopolymer/genipin). For the manufacture of scaffolds the freeze drying (lyophilization) technique is employed, where different cooling and sublimation rates are tested. The cooling rate can be slow (initially -5oC and then -55oC), intermediate (-55oC) or fast (-196oC), while the sublimation rate is adjusted by varying the pressure value in the lyophilization chamber at 0.1, 0.35 and 0.7mbar. The crystallinity, morphology and mechanical properties of the fabricated scaffolds are studied by means of Fourier transform infrared spectroscopy (FTIR), X- ray diffraction (XRD), scanning electron microscopy (SEM) and X-ray computed tomography (CT). As far as the type of cross-linker is concerned, the optimum content of glutaraldehyde has proved to be 1.7%, which leads to a satisfactory microporous and macroporous network, without displaying toxicity. Genipin, as a natural cross-linker, demonstrates much lower toxicity, but presents the drawback that the scaffolds lose their consistency in aqueous solution in less than 24 hours. As for the cooling and sublimation rate, the optimum values are -55oC and 0.35mbar, respectively, where the scaffolds show both macroporous (pore size up to 100μm) and microporous (~10μm) network, as well as adequate mechanical strength.