Ανίχνευση ομαδοποιημένων βλαβών στο DNA ανθρώπινων κυττάρων κατόπιν έκθεσης σε ιοντίζουσα ακτινοβολία

Abstract

Η έκθεση σε ιοντίζουσα ακτινοβολία (Ι.Α.) επάγει βλάβες στο κυτταρικό DNA, οι οποίες παρουσιάζουν ποικιλία και αρκετές φορές αυξημένη πολυπλοκότητα. Οι ομαδοποιημένες (σύνθετες) βλάβες του DNA και κυρίως οι δίκλωνες θραύσεις θεωρούνται ως οι περισσότερο επιβλαβείς, καθώς αν δεν επιδιορθωθούν μπορεί να οδηγήσουν σε κρίσιμες συνέπειες για την κυτταρική επιβίωση και αυξημένο κίνδυνο μεταλλάξεων και καρκινογένεσης. Η απόκριση των κυττάρων στις επαγόμενες βλάβες πραγματοποιείται με ενεργοποίηση ενός πολύπλοκου μηχανισμού που τις ανιχνεύει και τις επιδιορθώνει (μονοπάτι απόκρισης σε βλάβη του DNΑ). Στα σημεία των δίκλωνων θραύσεων η ιστόνη Η2ΑΧ φωσφορυλιώνεται άμεσα. Η φωσφορυλιωμένη ιστόνη γ-Η2ΑΧ, αποτελεί καίριας σημασίας παράγοντα στην απόκριση σε βλάβη του DNA και η οπτικοποίησή της με ανοσοφθορισμό (εστίες γ-Η2ΑΧ) επιτρέπει την εκτίμηση της βλάβης, μιας και υπάρχει σχέση αναλογίας μεταξύ του αριθμού των εστιών και των δίκλωνων θραύσεων. Ως εκ τούτου, οι εστίες γ-Η2ΑΧ μπορούν να χρησιμοποιηθούν ως βιοδείκτες της βλάβης, ενώ η σταδιακή μείωσή τους με το πέρας του χρόνου θεωρείται ένδειξη της επιδιόρθωσής της. Σε αυτή την εργασία μελετήθηκε η παρουσία των εστιών γ-Η2ΑΧ σε ανθρώπινα λεμφοκύτταρα περιφερικού αίματος, εκτεθειμένα ex vivo σε δόσεις από 0.2 έως 2 Gy ακτινοβολίας-γ και σε καρκινικά κύτταρα MCF-7 εκτεθειμένα σε δόσεις από 0.5 έως 4 Gy. Τα αποτελέσματα των πειραμάτων υπέδειξαν μια γραμμική συσχέτιση μεταξύ του αριθμού των επαγόμενων εστιών και της δόσης. Στην περίπτωση των λεμφοκυττάρων κρίθηκε σκόπιμη και η μελέτη της επιδιόρθωσης των βλαβών, η οποία αποκάλυψε μια εκθετική μείωση του αριθμού των επαγόμενων εστιών συναρτήσει του χρόνου μετά την ακτινοβόληση και πλήρη επιδιόρθωση των βλαβών λίγες ώρες αργότερα. Τέλος, έγινε προσπάθεια αυτόματης καταμέτρησης των εστιών με το λογισμικό Jcount και σύγκρισης των αποτελεσμάτων με την προηγούμενη μέθοδο. Τα αποτελέσματα της διπλωματικής εργασίας ενισχύουν την αντίληψη πως η γ-Η2ΑΧ μπορεί να χρησιμοποιηθεί ως βιοδοσίμετρο, αλλά και ως βιοδείκτης ακτινοευαισθησίας.

Ionizing radiation (IR) - induced DNA damage is diverse and sometimes considerably complex. Clustered (complex) DNA damages, especially double strand breaks (DSBs), are considered to be the most deleterious DNA lesions, which, if left unrepaired, may lead to serious consequences for cell survival, potential mutations and carcinogenesis through chromosomal instability. Cellular response to DNA damage starts with the activation of a complex mechanism, developed to detect and repair such lesions (DNA damage response pathway - DDR). Upon DNA DSB induction, the histone H2AX becomes rapidly phosphorylated. This modified form, γ-Η2ΑΧ, is a key factor for DDR (DSB repair) and its visualization by immunofluorescence (γ-H2AX foci) allows the assessment of DNA damage, as there is a direct relationship between foci number and DSB. Thus, γ-H2AX foci serve as a sensitive marker of DNA DSB induction, whilst reduction in foci number hours after exposure to IR is an evidence of DNA damage repair. In this study the presence of γ-H2AX foci is investigated in human peripheral blood lymphocytes exposed ex vivo to γ-rays, in a dose range of 0.2 to 2 Gy, as well as in MCF-7 cells exposed in a dose range of 0.5 to 4 Gy. Experimental results show that γ-H2AX foci induce linearly with radiation dose. In the case of lymphocytes, the investigation of DNA damage repair was deemed useful and therefore the analysis of the loss of γ-H2AX foci at various times after γ-ray exposure, reveals that the level of γ-H2AX foci reduces with time after irradiation and eventually a few hours is the time needed for full recovery of foci induction. Lastly, there was an effort for automatic focus counting with Jcount software. Results from this study amplify evidence that γ-H2AX may be useful for biodosimetry, as well as for the assessment of individual radiosensitivity.