Επίδραση οπτικής ακτινοβολίας στην τοπολογία κολλαγόνου με χρήση απεικονιστικής μικροσκοπίας ατομικής δύναμης και σάρωσης ηλεκτρονίων

Abstract

Αναμφισβήτητα, ισχυρή ανερχόμενη τάση στην νανο-τεχνολογία αποτελεί η αξιοποίηση εννοιών από τη φύση για να αναπτυχθούν μοντέλα υλικών υψηλής αποδοτικότητας, τα οποία θα αξιοποιηθούν σε αισθητήρες, λειτουργικές επιφάνειες κ.α., αλλά και να μελετηθούν εξωτερικές επιδράσεις με βιολογικά συστήματα, όπως η επίδραση ηλεκτρομαγνητικής ακτινοβολίας. Ιδιαίτερο ενδιαφέρον παρουσιάζουν τα μοντέλα αυτά όταν επιτρέπουν τη διερεύνηση αλληλεπιδράσεων στη νανοκλίμακα, καθώς η ανάπτυξη μεθόδων νανοτεχνολογίας ή νανοϋλικών αποτελούν σήμερα αιχμή της έρευνας σε ένα ευρύ φάσμα από επιστήμες και εφαρμογές. Αντικείμενο της Διδακτορική Διατριβής αποτελεί η ανάπτυξη λεπτών υμενίων κολλαγόνου και η αξιοποίηση τους ως μοντέλων βιολογικής διεπιφάνειας. Επίσης, αντικείμενο της έρευνας ήταν η αναπαραγωγή, ο έλεγχος και η ταυτοποίηση της τοπολογίας μέσω της ανάπτυξης τεχνικών Απεικονιστικής Μικροσκοπίας Ατομικής Δύναμης. Τα υμένια αξιοποιούνται για τη διερεύνηση και ερμηνεία των μηχανισμών επίδρασης της οπτικής ακτινοβολίας με το κολλαγόνο σε νανοκλίμακα. Η διερεύνηση της αλληλεπίδρασης του φωτός (σε όλο του το φάσμα) με το βιολογικό ιστό και η κατανόηση των εμπλεκόμενων μηχανισμών είναι κρίσιμης σημασίας, καθώς μπορεί να οδηγήσουν στην αξιοποίηση της ελάχιστα επεμβατικής ακτινοβολίας του φωτός για διαγνωστικούς και θεραπευτικούς σκοπούς. Επιπλέον, η επίδραση της οπτικής ακτινοβολίας με βιολογικό ιστό έχει συσχετιστεί με διάφορες παθολογικές καταστάσεις (για παράδειγμα η σχέση της υπεριώδους ακτινοβολίας με μορφές δερματικού καρκίνου ή της φωτογήρανσης), ενώ σε πολλές περιπτώσεις η οπτική ακτινοβολία μπορεί να χρησιμοποιηθεί ως μια μέθοδος επεξεργασίας βιοϋλικών (π.χ. για σκοπούς αποστείρωσης ή βελτίωσης των μηχανικών ιδιοτήτων). Παρόλο που οι αλληλεπιδράσεις της οπτικής ακτινοβολίας με το βιολογικό ιστό έχουν διερευνηθεί εκτεταμένα, οι μηχανισμοί που τις διέπουν στη νανοκλίμακα δεν έχουν αποσαφηνιστεί πλήρως και ιδιαίτερα η επίδραση σε επιφανειακά νανο-χαρακτηριστικά παραμένει αδιευκρίνιστη. Η επίδραση στη νανοτοπογραφία είναι καθοριστικής σημασίας καθώς η πλειοψηφία των βιολογικών αλληλεπιδράσεων διαδραματίζεται σε επιφάνειες ή/και διεπιφάνειες. Το κολλαγόνο, το οποίο χρησιμοποιήθηκε για την ανάπτυξη των μοντέλων βιολογικής επιφάνειας, αποτελεί το 25-30% της συνολικής πρωτεΐνης των θηλαστικών και είναι η πιο άφθονη πρωτεΐνη του εξωκυττάριου χώρου (Extracellular Matrix, ECM). Από τους 28 διαφορετικούς τύπους κολλαγόνου που έχουν μέχρι σήμερα αναγνωριστεί, το κολλαγόνο τύπου Ι είναι το πιο άφθονο και συναντάται σε ιστούς όπως το δέρμα, τα οστά, τους χόνδρους και τους τένοντες. Λόγω των ιδιαίτερων χαρακτηριστικών του (ινώδης μορφή, δυνατότητα αυτο-σχηματισμού, βιο-συμβατότητα, ενώ είναι βιο-διασπάσιμο και μη-τοξικό), το κολλαγόνο τύπου Ι χρησιμοποιείται ευρέως ως ένα από τα βασικότερα βιοϋλικά σε ένα μεγάλο εύρος από εφαρμογές στα πεδία των βιοϋλικών και της μηχανικής των ιστών. Η εκτεταμένη χρήση του σε βιοϊατρικές εφαρμογές καθώς και η αφθονία του στον οργανισμό οδήγησε στην επιλογή του για να διερευνηθεί η επίδραση της οπτικής ακτινοβολίας με αυτό (επομένως και με ιστούς πλούσιους σε κολλαγόνο), καθώς και να διασαφηνιστούν οι εμπλεκόμενοι μηχανισμοί. Επιμέρους αντικείμενα της έρευνας αποτέλεσαν: i) η ανάπτυξη τεχνικών χαρακτηρισμού και απεικόνισης λεπτών υμενίων κολλαγόνου στη νανοκλίμακα με Απεικονιστική Μικροσκοπία Ατομικής Δύναμης, ii) η ποσοτικοποίηση των επιφανειακών μεταβολών οι οποίες επέρχονται στο κολλαγόνο, από αλλαγές στις φυσικές ή χημικές ιδιότητες του, iii) η ανάπτυξη μοντέλων βιολογικής επιφάνειας με βάση το κολλαγόνο τα οποία χαρακτηριζόταν από: a. τη δυνατότητα ελέγχου της τοπογραφίας των υμενίων, ώστε να είναι δυνατός ο έλεγχος και ο προκαθορισμός των νανο-χαρακτηριστικών με επαναληψιμότητα και b. τη δυνατότητα υποστήριξης κυτταρικής καλλιέργειας, iv) η διερεύνηση της επίδραση επιφανειακών μεταβολών, στην τροποποίηση της κυτταρικής συμπεριφοράς και τον επακόλουθο έλεγχο της, v) η μελέτη της γένεσης δεύτερης αρμονικής από λεπτά υμένια κολλαγόνου, vi) η μελέτη επίδρασης υπεριώδους ακτινοβολίας με τα μοντέλα βιολογικής επιφάνειας με βάση τα λεπτά υμένια κολλαγόνου , vii) η μελέτη επίδρασης ακτινοβολίας laser χαμηλής ισχύος στην περιοχή του ερυθρού με τα μοντέλα βιολογικής επιφάνειας με βάση τα λεπτά υμένια κολλαγόνου και viii) η μελέτη της διαφοροποίησης της κυτταρικής συμπεριφοράς λόγω των επαγόμενων αλλαγών στην τοπογραφία του μοντέλου βιολογικής επιφάνειας υπό την επίδραση της υπεριώδους ακτινοβολίας και της χαμηλής ισχύος ακτινοβολίας laser στην περιοχή του ερυθρού. Τα μήκη κύματος τα οποία επιλέχθηκαν καλύπτουν ένα ευρύ φάσμα της οπτικής ακτινοβολίας και παρουσιάζουν ιδιαίτερες εφαρμογές στη βιοϊατρική. Συγκεκριμένα, στα πλαίσια της Διδακτορικής Διατριβής διερευνήθηκε η δυνατότητα Γένεσης Δεύτερης Αρμονικής (Second Harmonic Generation, SHG) από τα λεπτά υμένια κολλαγόνου μετά από διέγερση με laser στην περιοχή του εγγύς υπερύθρου (Near Infrared, NIR). Η γένεση αυτού του σήματος μπορεί να αξιοποιηθεί για την ανάπτυξη τεχνικών μη-γραμμικής οπτικής ως διαγνωστικού εργαλείου για την ανίχνευση παθολογικών καταστάσεων που σχετίζονται με διαφοροποίηση των χαρακτηριστικών των ινών κολλαγόνου. Στη συνέχεια, διερευνήθηκε η επίδραση της υπεριώδους ακτινοβολίας (UV) με το κολλαγόνο. Δεδομένου ότι η UV ακτινοβολία έχει συσχετιστεί με διάφορες παθολογικές καταστάσεις, όπως φωτογήρανση, και η ακτινοβολία αυτή χρησιμοποιείται για την επεξεργασία βιολογικών υλικών κολλαγόνου για σκοπούς αποστείρωσης ή ανάπτυξης σταυροδεσμών για βελτίωση των ιδιοτήτων τους. Τέλος, διερευνήθηκε η επίδραση της χαμηλής ισχύος ακτινοβολίας laser στην περιοχή του ερυθρού (Low-Level Red Laser, LLRL), η οποία χρησιμοποιείται ευρέως για τη θεραπεία με laser χαμηλής ισχύος (Low-Level Laser Therapy, LLLT). Η LLLT μπορεί να χρησιμοποιηθεί για την αντιμετώπιση ενός εύρους παθολογικών καταστάσεων, μεταξύ των οποίων και η αξιοποίηση της για την επούλωση πληγών. Για τις περιπτώσεις της ακτινοβόλησης με UV και LLRL διερευνήθηκε επιπλέον και η έμμεση επίδραση της οπτικής ακτινοβολίας στην κυτταρική συμπεριφορά, και συγκεκριμένα σε δερματικούς ινοβλάστες, μέσω της χρησιμοποίησης ακτινοβολημένων υμενίων ως υποστρωμάτων καλλιέργειας κυττάρων. Προκειμένου να πραγματοποιηθεί η διερεύνηση της επίδρασης της οπτικής ακτινοβολίας, πρώτο βήμα αποτέλεσε η ανάπτυξη λεπτών υμενίων κολλαγόνου τα οποία θα λειτουργούσαν ως μοντέλα βιολογικής επιφάνειας/διεπιφάνειας με καθορισμένη ή/και ελεγχόμενη τοπογραφία στη νανοκλίμακα. Για την ανάπτυξη υμενίων με προκαθορισμένα επιφανειακά χαρακτηριστικά, αναπτύχθηκαν κατάλληλα πρωτόκολλα ανάπτυξης λεπτών υμενίων κολλαγόνου. Τα πρωτόκολλα αυτά επέτρεψαν τη διερεύνηση της επίδρασης που έχουν διάφοροι φυσικοχημικοί παράγοντες (π.χ. pH, θερμοκρασίας, χρόνος ινιδιογένεσης, χρόνος προσρόφησης) στα επιφανειακά χαρακτηριστικά των υμενίων. Επιπλέον, διερευνήθηκε η επίδραση των διαφορετικών μεθόδων σχηματισμού υμενίων και των διαφορετικών υποστρωμάτων στα λεπτά υμένια. Για να πραγματοποιηθεί η απεικόνιση και ο νανοχαρακτηρισμός των λεπτών υμενίων κολλαγόνου και να επιτευχθεί η ποσοτικοποίηση συγκεκριμένων επιφανειακών χαρακτηριστικών, αναπτύχθηκαν τεχνικές υψηλής ανάλυσης απεικονιστικής Μικροσκοπίας Ατομικής Δύναμης (Atomic Force Microscopy, AFM), οι οποίες συνδυάστηκαν με τις παρεχόμενες πληροφορίας από Μικροσκοπία Σάρωσης Ηλεκτρονίων (Scanning Electron Microscopy, SEM). Τα αποτελέσματα έδειξαν, ότι οι δύο μέθοδοι απεικόνισης σε νανοκλίμακα προσφέρουν συμπληρωματική πληροφορία ώστε να πραγματοποιηθεί πληρέστερος χαρακτηρισμός των υμενίων και των χρησιμοποιούμενων υποστρωμάτων. Το AFM αναδείχθηκε καταλληλότερο για την απεικόνιση και το χαρακτηρισμό συγκεκριμένων χαρακτηριστικών μόλις μερικών νανομέτρων στις επιφάνειες των υμενίων κολλαγόνου. Επιπλέον, η απεικόνιση με AFM απαιτούσε ελάχιστη προετοιμασία των δειγμάτων χωρίς τη χρήση επεμβατικών μεθόδων (π.χ. χρήση χρωστικών ή την επικάλυψη του δείγματος με αγώγιμα υμένια) με αποτέλεσμα τα δείγματα να μην δέχονται οποιαδήποτε επέμβαση η οποία θα αλλοίωνε τα επιφανειακά χαρακτηριστικά τους. Το SEM προσέφερε συμπληρωματική πληροφορία για την απεικόνιση μεγαλύτερων περιοχών δειγμάτων (της τάξης μερικών μικρών) και μεγαλύτερων δομών κολλαγόνου και γενικά περιοχών των δειγμάτων ή δομών κολλαγόνου όπου η ακίδα του AFM αδυνατούσε να δώσει πληροφορία. Ταυτόχρονα, χρησιμοποιήθηκαν τεχνικές ανάλυσης και επεξεργασίας εικόνας για την απόκτηση ποιοτικών αλλά και ποσοτικών δεδομένων από τις αποκτηθείσες εικόνες. Οι μέθοδοι σχηματισμού λεπτών υμενίων κολλαγόνου που χρησιμοποιήθηκαν ήταν η αποξήρανση στον αέρα, η διαδικασία φυγοκεντρικής επίστρωσης (Spin Coating, SpC), η χρήση της υδροδυναμικής ροής (Hydrodynamic Flow, HF) και τέλος ο συνδυασμός SpC-HF. Τα αποτελέσματα έδειξαν, ότι κάθε μια από τις μεθόδους επέτρεψε το σχηματισμό υμενίων με διαφορετικά χαρακτηριστικά. Με τη μέθοδο αποξήρανσης στον αέρα σχηματίστηκαν υμένια σχετικά μεγάλου πάχους, ανομοιογενείς, με ίνες/ινίδια κολλαγόνου με τυχαίο προσανατολισμό και με την παρουσία συσσωματωμάτων κολλαγόνου. Η SpC επέτρεψε το σχηματισμό εξαιρετικά λεπτών και ομοιογενών υμενίων κολλαγόνου, αποτελούμενων από ινίδια κολλαγόνου με φυσιολογικά χαρακτηριστικά και τυχαίο προσανατολισμό. Μέσω της HF, σχηματίστηκαν λεπτά υμένια κολλαγόνου αποτελούμενα από προσανατολισμένες ίνες/ινίδια κολλαγόνου, ενώ ο συνδυασμός SpC-HF επέτρεψε τη διαμόρφωση υμενίων από δομές κολλαγόνου με δυο προσανατολισμούς (ο ένας κάθετος στον άλλο). Από τα διαφορετικά υποστρώματα που χρησιμοποιήθηκαν η μίκα (mica) φάνηκε να υπερτερεί έναντι των υποστρωμάτων από γυαλί, καθώς επέτρεπε το σχηματισμό λεπτότερων και πλέον ομοιογενών υμενίων. Η κρυσταλλική φύση και οι επιφανειακές ιδιότητες της μίκας επιτρέπουν την καλύτερη προσρόφηση του κολλαγόνου και το σχηματισμό ινών/ινιδίων κολλαγόνου με φυσιολογικά χαρακτηριστικά, όπως η D-περιοδικότητα των ~67 nm. Επιπρόσθετα, ιδιαίτερο ενδιαφέρον παρουσιάζουν τα υποστρώματα που αναπτύχθηκαν σε επιφάνειες από σωματίδια πολυστυρένιου(Polystyrene Particle Surfaces, PPS). Μέσω της χρήσης νανο-σωματιδίων πολυστυρένιου και της βελτιστοποίησης των παραμέτρων σχηματισμού των PPS, έγινε κατορθωτός ο σχηματισμός ομοιόμορφων νανοδομημένων επιφανειών. Οι επιφάνειες αυτές αποδείχτηκε ότι είναι κατάλληλες για το σχηματισμό υμενίων κολλαγόνου με ίνες/ινίδια κολλαγόνου που παρουσιάζουν φυσιολογικά χαρακτηριστικά και μπορούν να αποτελέσουν ένα εξαιρετικό μοντέλο/εργαλείο για διερεύνηση της σχέσης συγκεκριμένων νανοχαρακτηριστικών με την προσρόφηση και το σχηματισμό ινιδίων κολλαγόνου ή άλλων πρωτεϊνών. Η μελέτη και χρήση διαφορετικών υποστρωμάτων καθώς και διαφορετικών μεθόδων επίστρωσης, επέτρεψε την ανάπτυξη λεπτών υμενίων κολλαγόνου με προκαθορισμένα επιφανειακά χαρακτηριστικά. Με τον τρόπο αυτό, μέσω της χρήσης του κατάλληλου υποστρώματος ή μεθόδου επίστρωσης ήταν δυνατός ο έλεγχος χαρακτηριστικών όπως το πάχος του υμενίου, το μέγεθος των δομών του κολλαγόνου, η ινώδης ή όχι μορφή του κολλαγόνου, η παρουσία ή όχι φυσιολογικών χαρακτηριστικών (π.χ. διάμετρος στις ίνες, D-περιοδικότητα) η ομοιογένεια του δείγματος και ο προσανατολισμός των ινών. Ο χαρακτηρισμός και η ποσοτικοποίηση της τοπογραφίας των λεπτών υμενίων κολλαγόνου καθώς και η ελεγχόμενη τροποποίηση της επιφάνειας επέτρεψε να αξιοποιηθούν τα υμένια ως μοντέλα βιολογικής επιφάνειας/διεπιφάνειας για τη διερεύνηση των επιφανειακών χαρακτηριστικών στην κυτταρική συμπεριφορά καθώς και στην επίδραση οπτικής ακτινοβολίας. Τα μοντέλα βιολογικής επιφάνειας που αναπτύχθηκαν αποτελούνταν από αυτό-διαμορφωμένα ινίδια και ίνες κολλαγόνου, τα οποία παρουσίαζαν φυσιολογικά χαρακτηριστικά, όπως η D-περιοδικότητα. Τα λεπτά αυτά υμένια σχηματίστηκαν με τις διαφορετικές μεθόδους και πάνω στα διαφορετικά υποστρώματα (μίκα, γυαλί, PPS) ανάλογα με τα επιφανειακά χαρακτηριστικά που απαιτούνταν σε κάθε περίπτωση. Για τη διερεύνηση των οπτικών ιδιοτήτων αξιοποιήθηκαν τα υμένια που σχηματίστηκαν πάνω σε μίκα, η οποία λόγω της κρυσταλλικής φύσης της και της ιδιαίτερα επίπεδης επιφάνειας της, επιτρέπει την απεικόνιση στη νανοκλίμακα με τη μικροσκοπία AFM. Τα άλλα δύο υποστρώματα (γυαλί, PPS) επέτρεψαν το μοντέλο της βιολογικής επιφάνειας να αξιοποιηθεί για τη διερεύνηση της προσρόφησης και του σχηματισμού ινιδίων κολλαγόνου σε διαφορετικά υποστρώματα. Αρχικά, τα μοντέλα βιολογικής επιφάνειας που αναπτύχθηκαν αξιοποιήθηκαν για τη διερεύνηση της διαδικασίας με την οποία συγκεκριμένα επιφανειακά επιδρούν στην κυτταρική συμπεριφορά. Τα μοντέλα λεπτών υμενίων κολλαγόνου, χρησιμοποιήθηκαν ως υποστρώματα για την ανάπτυξη πρωτογενούς καλλιέργειας ανθρώπινων δερματικών ινοβλαστών. Από τα αποτελέσματα προέκυψε, ότι τα υμένια μπορούν να αποτελέσουν υποστρώματα φυσιολογικής καλλιέργειας κυττάρων και ότι οι ινοβλάστες αποκρίνονται στην τοπογραφία των υμενίων. Στην περίπτωση που χρησιμοποιήθηκαν υμένια κολλαγόνου με προσανατολισμένες ίνες/ινίδια, οι ινοβλάστες ακολούθησαν την κύρια κατεύθυνση των ινών του κολλαγόνου, ενώ στα υμένια με τυχαία προσανατολισμένες ίνες οι ινοβλάστες δεν παρουσιάζουν κανένα πρότυπο διευθέτησης τους στο χώρο κατά την ανάπτυξη τους. Στα πλαίσια της διατριβής αναπτύχθηκε μέθοδος ταυτόχρονης απεικόνισης με AFM τόσον των ινοβλαστών όσο και των ινών κολλαγόνου του υποστρώματος, ώστε να γίνει και ποιοτική παρουσίαση του προσανατολισμού των ινοβλαστών με τα χαρακτηριστικά του υποστρώματος. Επιπλέον, η παρούσα διατριβή στο συγκεκριμένο πεδίο έρευνας παρουσίασε για πρώτη φορά ποσοτική μέτρηση και γραφική αναπαράσταση του προσανατολισμού (μέσω των Διαγραμμάτων Κατανομής Προσανατολισμού) των ινών του κολλαγόνου στη νανοκλίμακα με μεθόδους AFM και επεξεργασίας εικόνας. Στην περίπτωση μελέτης του σήματος SHG, το μοντέλο της βιολογικής επιφάνειας/διεπιφάνειας με βάση το κολλαγόνο και οι διατάξεις που αναπτύχθηκαν χρησιμοποιήθηκαν προκειμένου να διερευνηθεί η δυνατότητα παραγωγής SHG από λεπτά υμένια και να βρεθεί η σχέση της γωνίας πόλωσης της διεγείρουσας ακτινοβολίας με τον προσανατολισμό των ινών κολλαγόνου. Επιπρόσθετα, λεπτά υμένια σχηματισμένα από θερμικά αποδιαμορφωμένο κολλαγόνο αξιοποιήθηκαν για τη συσχέτιση του σήματος SHG με τις επιπτώσεις της θερμικής αποδιαμόρφωσης στις ίνες/ινίδια κολλαγόνου. Τα αποτελέσματα έδειξαν, ότι τα λεπτά υμένια είναι κατάλληλα για την ανίχνευση και διερεύνηση ασθενών σημάτων SHG από κολλαγόνο όταν η διέγερση πραγματοποιείται με μικρές εντάσεις. Μέσω της χρήσης πολωτή φωτός για τη διεγείρουσα ακτινοβολία, είναι δυνατή η ανίχνευση του προσανατολισμού των ινών κολλαγόνου. Επιπλέον, παρουσιάστηκε ότι το σήμα SHG μειώνεται όταν οι ίνες κολλαγόνου αποδιαμορφώνονται. Επομένως, οι μετρήσεις του SHG σήματος μπορούν να χρησιμοποιηθούν για την εύρεση του προσανατολισμού των ινών/ινιδίων κολλαγόνου καθώς και για την ανίχνευση διαφοροποιήσεων του προσανατολισμού ή της ινώδους δομής του κολλαγόνου. Οι διαφοροποιήσεις αυτές μπορεί να παρατηρηθούν σε διάφορες παθολογικές καταστάσεις και η SHG μπορεί να αξιοποιηθεί ως ένα διαγνωστικό εργαλείο ή μέθοδος παρατήρησης τους, ενώ το μοντέλο της βιολογικής επιφάνειας με βάση το κολλαγόνο που αναπτύχθηκε μπορεί να αξιοποιηθεί ως εργαλείο προσομοίωσης των παθολογικών αυτών αλλοιώσεων του κολλαγόνου ώστε να βρεθεί η ακριβής σχέση με το εκπεμπόμενο σήμα SHG για κάθε περίπτωση. Ιδιαίτερη καινοτομία της παρούσας Διδακτορικής Διατριβής στην ενότητα αυτή αποτελεί το γεγονός ότι πρώτη φορά χρησιμοποιήθηκαν λεπτά υμένια κολλαγόνου με νανοδομημένα και προκαθορισμένα χαρακτηριστικά για το συσχετισμό συγκεκριμένων επιφανειακών χαρακτηριστικών του κολλαγόνου με το εκπεμπόμενο σήμα SHG. Στην περίπτωση της επίδρασης της υπεριώδους ακτινοβολίας (UV, 254 nm) στο κολλαγόνο, τα λεπτά υμένια επέτρεψαν τη διερεύνηση των διαφοροποιήσεων που προκύπτουν από την UV-ακτινοβόληση στις οπτικές ιδιότητες του κολλαγόνου (φθορισμό, απορρόφηση) και στην τοπογραφία του και την διερεύνηση της ικανότητας χρήσης τους ως υποστρώματος καλλιέργειας κυττάρων. Παράλληλα, διερευνήθηκε αν υπάρχει διαφοροποίηση των υπό μελέτη παραμέτρων όταν η ακτινοβόληση πραγματοποιείται στο διάλυμα κολλαγόνου πριν την επίστρωση των υμενίων ή στο τελικό διαμορφωμένο υμένιο. Τα αποτελέσματα έδειξαν, ότι για τις δόσεις και χρόνους που χρησιμοποιήθηκαν (οι οποίοι είναι της τάξης αυτών που χρησιμοποιούνται για αποστείρωση ή για ανάπτυξη σταυροδεσμών και βελτίωση των μηχανικών ιδιοτήτων των βιοϋλικών κολλαγόνου) ο φθορισμός του κολλαγόνου αυξάνεται, με ταυτόχρονη αύξηση της απορρόφησης. Οι αλλαγές αυτές στα φάσματα οφείλονται στη φωτο-αποδόμηση που προκαλεί η UV ακτινοβολία στο ινώδες κολλαγόνο. Αυτό έχει ως αποτέλεσμα δομικές αλλαγές στις περιοχές των τμημάτων αρωματικών αμινοξέων ή των ίδιων των αμινοξέων και συγκεκριμένα σπάσιμο του πεπτιδικού δεσμού και ακολούθως αύξηση των φωτοπροϊόντων από την Τυροσίνης και την Φαινυλαλαλίνης. Στην περίπτωση όπου η ακτινοβόληση πραγματοποιόταν απευθείας στο λεπτό υμένιο για μικρούς χρόνους ακτινοβόλησης και μικρές δόσεις ενέργειας, η τοπογραφία δεν αλλοιωνόταν καθώς δεν ανιχνεύτηκαν διαφοροποιήσεις στις ίνες του κολλαγόνου (ινώδης μορφή, D-περιοδικότητα, διάμετρος ινών) ή στην τραχύτητα της επιφάνειας. Όμως στην περίπτωση των υμενίων που σχηματίζονταν από το UV-ακτινοβολημένο κολλαγόνο παρόλο που δεν παρατηρήθηκαν αλλοιώσεις στις ίνες/ινίδια του κολλαγόνου, η επιφανειακή τραχύτητα παρουσίασε αυξομειώσεις, γεγονός το οποίο υποδηλώνει ότι η φωτο-αποδόμηση είναι μια αντιστρέψιμη διαδικασία όταν η UV-ακτινοβόληση γίνει σε υγρό περιβάλλον. Τα αποτελέσματα υποδεικνύουν ότι η μέθοδος αυτή μπορεί να αξιοποιηθεί για έλεγχο της επιφανειακής τραχύτητας, η οποία διαδραματίζει σημαντικό ρόλο στις βιοϊατρικές εφαρμογές, ειδικά όταν οι επιφάνειες έρχονται σε επαφή με κύτταρα. Επιπρόσθετα, διερευνήθηκε η επίδραση της UV ακτινοβολίας για μεγάλους χρόνους ακτινοβόλησης, ώστε να παρατηρηθεί στη νανοκλίμακα η πιθανή διαφοροποίηση των ινών του κολλαγόνου και της D-περιοδικότητας. Τα αποτελέσματα της ανάπτυξης πρωτογενούς καλλιέργειας ανθρώπινων δερματικών ινοβλαστών στα λεπτά υμένια και στις δυο περιπτώσεις έδειξαν, ότι η συμπεριφορά των κυττάρων επηρεάστηκε από την ακτινοβόληση. Με την αύξηση του χρόνου ακτινοβόλησης, το σώμα των ινοβλαστών και των πυρήνων τους γινόταν όλο και πιο σφαιρικό, γεγονός το οποίο για τους ινοβλάστες αποτελεί ένδειξη μη φυσιολογικής ανάπτυξης. Επομένως, τα αποτελέσματα της διδακτορικής διατριβής, υποδεικνύουν ότι η επεξεργασία με UV-ακτινοβολία υλικών με βάση το κολλαγόνο, πρέπει να αποφεύγεται ή να περιορίζεται όταν τα υλικά αυτά πρόκειται να χρησιμοποιηθούν σε εφαρμογές που έρχονται σε επαφή με κύτταρα. Η τελευταία οπτική ακτινοβολία, η οποία διερευνήθηκε με τη χρήση των λεπτών υμενίων κολλαγόνου ως μοντέλο βιολογικής επιφάνειας, ήταν η χαμηλής ισχύος ακτινοβολία laser στην περιοχή του ερυθρού (LLRL, 661 nm). Τα πειραματικά αποτελέσματα έδειξαν, ότι ενώ παρατηρήθηκαν μικρές αυξήσεις στην ένταση του εκπεμπόμενου φθορισμού, δεν ανιχνεύτηκαν αλλαγές στη νανο-τοπογραφία του κολλαγόνου μετά την ακτινοβόληση. Πρέπει να σημειωθεί, ότι οι παράμετροι ακτινοβόλησης (μήκος κύματος, δόση, χρόνος ακτινοβόλησης) είναι της τάξης μεγέθους με αυτές που χρησιμοποιούνται για τη θεραπεία με laser χαμηλής ισχύος (LLLT). Ιδιαίτερο ενδιαφέρον παρουσιάζει το γεγονός ότι οι ινοβλάστες διαφοροποιήθηκαν όταν τα LLRL-ακτινοβολημένα υμένια χρησιμοποιήθηκαν ως υπόστρωμα για την καλλιέργεια των κυττάρων. Με την αύξηση των επαναλήψεων ακτινοβόλησης και επομένως της προσφερόμενης δόσης στα λεπτά υμένια, οι ινοβλάστες γίνονταν όλο και πιο σφαιρικοί. Αυτό αποτελεί ένδειξη μη φυσιολογικής ανάπτυξης των ινοβλαστών, όπως αυτή που παρατηρήθηκε στα UV-ακτινοβολημένα υμένια. Η διδακτορική διατριβή εστίασε στην επίδραση της LLRL στο ίδιο το κολλαγόνο και για πρώτη φορά στη διεθνή βιβλιογραφία αναδείχτηκε ότι η ακτινοβόληση με LLRL μπορεί να έχει αρνητική επίδραση στην ανάπτυξη των κυττάρων λόγω των επιπτώσεων της ακτινοβόλησης. Το στοιχείο αυτό αποτελεί μια σημαντική νέα πληροφορία που προσφέρει νέα δεδομένα για την αποσαφήνιση του μηχανισμού δράσης της LLLT. Καθώς η διαφοροποίηση της κυτταρικής συμπεριφοράς παρατηρήθηκε απουσία μετρήσιμων επιφανειακών αλλαγών, προκύπτει ότι η αλλαγή της κυτταρικής συμπεριφοράς λόγω της ακτινοβόλησης με LLLT δεν οφείλεται σε μηχανισμούς αλληλεπίδρασης (ή καθοδήγησης) που βασίζονται σε επιφανειακές ιδιότητες. Τα αποτελέσματα αυτά οδηγούν προς μια νέα διάσταση διερεύνησης των εμπλεκόμενων φαινομένων και προτείνουν ότι για την ολοκλήρωση της ερμηνείας του μηχανισμού της LLLT απαιτείται η διερεύνηση της δράσης της LLRL (ή άλλης χαμηλής ισχύος ακτινοβολίας) σε άλλες ιδιότητες του ιστού (όπως η αλλοίωση των μηχανικών ιδιοτήτων) καθώς και της διερεύνησης της επίδρασες της LLRL σε κάθε επιμέρους στοιχείου του ιστού. Από τη Διδακτορική Διατριβή, προέκυψαν σημαντικά αποτελέσματα σχετικά με το μοντέλο της ίνας του κολλαγόνου και τις μεθόδους διερεύνησης του. Τα αποτελέσματα που προέκυψαν έδειξαν ότι τα πρωτόκολλα που αναπτύχθηκαν είναι κατάλληλα για το σχηματισμό ινών κολλαγόνου με πολυμορφισμό, δηλαδή την ύπαρξη περισσότερων από μια περιοδικότητες κατά μήκος των ινών (π.χ. D-περιοδικότητα της τάξης των ~67 και ~100 nm ταυτόχρονα). Το ιδιαίτερο με το πρωτόκολλο που αναπτύχθηκε είναι το γεγονός ότι το μητρικό διάλυμα κολλαγόνου αποτελείτο από υψηλή συγκέντρωση κολλαγόνου, χωρίς την προσθήκη άλλων ουσιών που παραδοσιακά χρησιμοποιούνται για την ανάπτυξη ινών κολλαγόνου με πολυμορφισμό. Επιπλέον, η χρήση φυγοκεντρικής επίστρωσης επέτρεψε το σχηματισμό ινών κολλαγόνου με γόνατα (περιοχές δηλαδή κατά μήκος της ίνας όπου η ίνα αλλάζει απότομα διεύθυνση). Τα γόνατα αυτά σχηματίζονται λόγω των μεγάλων φυγοκεντρικών δυνάμεων που δέχονται οι ίνες και αποτελούν μηχανικές παραμορφώσεις παρόμοιες με αυτές των σωλήνων (δηλαδή δομών με επίμηκες σχήμα, οι οποίες είτε είναι κενές στο εσωτερικό είτε αποτελούνται από σκληρότερο περίβλημα). Τέλος, κατά την ακτινοβόληση με UV για μεγάλους χρόνους ακτινοβόλησης (που πραγματοποιήθηκε για τη διερεύνηση της επίδραση UV ακτινοβολίας-κολλαγόνου) δημιουργήθηκαν κρατήρες στην επιφάνεια των ινών. Η απεικόνιση με AFM επέτρεψε την απεικόνιση της D-περιοδικότητας στο εσωτερικό της ίνας, δηλαδή κάτω από τον κατεστραμμένο εξωτερικό φλοιό. Συνδυάζοντας τα αποτελέσματα αυτά, προέκυψε ένα μοντέλο της ίνας του κολλαγόνου σύμφωνα με το οποίο συμπεριφέρεται σαν σωλήνας (“tube”) και αποτελείται από πολλαπλούς φλοιούς, με τον εξωτερικό φλοιό να είναι σκληρότερος, και τη D-περιοδικότητα να συνεχίζεται στους εσωτερικούς φλοιούς. Τα αποτελέσματα όλων των προαναφερθέντων μελετών επεξεργάστηκαν ποιοτικά, ποσοτικά και θεωρητικά και συγκρίθηκαν με τα αποτελέσματα τα οποία παρουσιάζονται στη διεθνή βιβλιογραφία. Βάσει των συμπερασμάτων που εξάγονται προέκυψε ότι αυτή η διατριβή συνεισφέρει σημαντικά σε ένα ευρύ φάσμα από ερευνητικά πεδία καθώς συνέβαλε σε μεγάλο βαθμό στην εξέλιξη της έρευνας τόσον στο πεδίο του νανοχαρακτηρισμού-νανοαπεικόνισης βιοϋλικών, όσον και στο πεδίο της διερεύνησης της αλληλεπίδρασης οπτικής ακτινοβολίας με το βιολογικό ιστό. Τα αποτελέσματα που προέκυψαν έτυχαν διεθνούς αναγνώρισης, ενώ οι τεχνικές και τα μοντέλα που αναπτύχθηκαν αναμένεται να αποτελέσουν σημαντικά εργαλεία σε ένα πλήθος ερευνητικών ή βιοϊατρικών εφαρμογών ιδιαίτερα στα πεδία των νανο-βιοϋλικών και της μηχανικής του ιστού.

The development of nano-materials and nanotechnology-based methods is a cutting edge research in a wide range of disciplines and applications and the models which allow the investigation of nanoscale interactions are of particular interest. Nowadays in nanotechnology a strong rising trend is the adoption of concepts from the nature for the development of high-efficiency bio-materials, which could be used as sensors, functional surfaces etc. Also these bio-materials are used as models for investigating the influence of external factors, such as electromagnetic radiation. The main aim of this PhD thesis was the development of collagen thin films and their use as biological interface models. Moreover, aim was the reproduction, control and identification of their topography with Atomic Force Microscopy imaging techniques. The films were used for the investigation and interpretation of the nanoscale effects of optical radiation on collagen. The understanding of the involved mechanisms in biological tissue-light (across the entire optical spectrum) interactions is crucial, as it can lead to the use of the minimally invasive light radiation for diagnostic and therapeutic purposes. Furthermore, the effects of optical radiation on biological tissue has been associated with various pathological conditions (for example, the relationship of ultraviolet radiation with photo-aging or several forms of skin cancer), while in many cases the optical radiation can be used as a method of treating biomaterials (e.g. for sterilization purposes). Although the interactions of the optical radiation with biological tissue have been investigated extensively, the governing mechanisms at the nanoscale have not been clarified and the effects on surface nano-features remain unclear. The effects on the nano-topography are of paramount importance as the majority of biological interactions take place on surfaces and/or interfaces. Collagen was selected for the development of the biological surface models as is the most abundant protein of the extracellular matrix (Extracellular Matrix, ECM) and covers the 25-30% of the total protein of mammals. From the 28 different types of collagen that have been identified so far, type I collagen is the most abundant and is found in tissues such as skin, bone, cartilage and tendons. Due to its particular characteristics (fibrous nature, ability for self-assembly, bio-compatibility, bio-degradability and non-toxicity) type I collagen is widely used as one of the main biomaterials in a wide range of applications in the fields of biomaterials and tissue engineering. Its abundance in the human body and its extensive use in biomedical applications, led to its selection for the investigation of the effects of optical radiation on it (and therefore on collagen-rich tissues) and the clarification of the involved mechanisms. The research objectives of this research were: i) the development of Atomic Force Microscopy imaging techniques for the nanoscale characterization and imaging of collagen thin films ii) the quantification of surface changes occurring in collagen thin films due alterations in collagen physical and/or chemical properties a. the development of collagen thin films based biological surface models which were characterized by: b. the ability to control the nano-topography of the films, so as to pre-determine the surface features with repeatability and iii) the ability to support cell culture iv) the investigation and subsequent control of cell behavior alterations due to the effect of surface changes, v) the study of second harmonic generation from thin films of collagen, vi) the investigation of the effect of ultraviolet radiation on collagen thin films, vii) the investigation of the effect of low level laser radiation in the red on collagen thin films, viii) the investigation of the alterations of cell behavior due to the induced changes on the biological surface model topography under the influence of ultraviolet and low level laser radiation in the red region. The selected wavelengths cover a wide range of the optical spectrum and have noticeable applications in biomedicine. More specifically, the mechanism of the Second Harmonic Generation (SHG), by near infrared (NIR) laser stimulation, from collagen thin films was investigated. The genesis of this signal can be used to develop non-linear techniques which can be applied for diagnostic purposes, so as to detect pathological conditions associated with collagen fibers differentiation. Moreover, the effects of ultraviolet radiation (UV) on collagen were investigated. The UV radiation has been associated with various pathological conditions (such as photo-aging) and is used for the treatment of collagen-based bio-materials for sterilization or cross-linking purposes. Furthermore, the effects of Low Level Laser radiation in the red region of the optical spectrum (Low-Level Red Laser, LLRL), which is widely used for the treatment with low-power laser (Low-Level Laser Therapy, LLLT) were investigated. The LLLT can be used to treat a range of pathological conditions, including healing wounds. The investigation of UV and LLRL irradiation was further expanded in the study of the indirect effects of the optical radiation on cell behavior (particularly in dermal fibroblasts), by using irradiated collagen films as cell culture substrates. In order to carry out this investigation, the first step was the development of collagen thin films that could be used as a biological surface/interface model, with pre-determined (fixed) and/or controlled nanoscale topography. Appropriate protocols were developed for the development of thin films with pre-determined surface characteristics. These protocols allowed the investigation of the influence of different physicochemical factors (e.g. pH, temperature, time fibrillogenesis, adsorption time) on the surface characteristics of the developed collagen thin films. Furthermore, it has been studied how the different formation methodologies influence the thin films characteristics. AFM high resolution imaging techniques were developed for the qualitative and quantitative nano-characterization of the collagen thin films and were combined with the information that was provided by Scanning Electron Microscopy (SEM) imaging. The results showed that the two aforementioned microscopy techniques provided combinational information for a thorough characterization of films and the substrates that were used. The AFM techniques were shown to be suitable for imaging and characterizing of specific nanoscale features on the surfaces of the collagen films. Furthermore, the AFM imaging demanded minimal sample preparation, free of invasive techniques (such as the use of dyes or the coating of the sample with conductive films). As a result, samples did not accept any procedure that could alter their surface characteristics. The SEM imaging provided additional information for the characterization of larger sample areas (of the order of a few microns). Also, SEM had better performance on larger collagen structures and general in areas of samples where the AFM tip is unable to provide information. Moreover, advanced image analysis and processing techniques were used in order to obtain qualitative and quantitative data from the acquired images. The methods that were used to form collagen thin films were: drying in the air, the Spin Coating (SpC) process, the use of Hydrodynamic Flow (HF) and finally the combination SpC-HF. The results showed that each of these methods allowed the formation of films with different characteristics. By using the method of drying in the air, the formed films were relatively thick, homogeneous, consisting of collagen fiber/fibrils with random orientation and with collagen aggregations. The SpC process, allowed the formation of ultra-thin and homogeneous collagen films, consisting of collagen fibrils with physiological characteristics and random orientation. The HF leaded to the formation of collagen thin films with oriented fibrils, while the combination SpC-HF films allowed the formation of collagen structures with two major orientations (perpendicular to each other). Among the different substrates that were used, mica substrates presented to have better performance than glass substrates, as they allowed the formation of finer and more homogeneous films. The crystalline nature and the surface properties of mica appeared to allow better adsorption of collagen fibers and the formation of fibrils with physiological characteristics, such as the D-periodicity of ~ 67 nm. Additionally, of particular interest were the surfaces of polystyrene particles (Polystyrene Particle Surfaces, PPS) which were formed and used as substrates. By using polystyrene nano-particles and by optimizing the formation parameters, it was achieved the formation of uniform nanostructured surfaces. These surfaces are shown to be suitable substrates for the formation of thin collagen films exhibiting physiological characteristics. Moreover, they can be used as an excellent model/tool for investigating the relationship between specific surface nano-characteristics and the adsorption of collagen fibrils or other proteins. The investigation and use of different substrates and different thin films formation methodologies, allowed the development of collagen thin film with pre-determined surface characteristics. The control of surface nano-characteristics (like the fibers diameter, the D-band), the homogeneity of the samples and the orientation of the fibers was achieved by using appropriate substrate or/and formation methodology. The characterization, the quantification and the control of the collagen thin films topography allowed the films to be used as biological surface models for the investigation of the influence of the surface characteristics on cell behavior and the study of the effects of optical radiation. The development of biological surface models consisted from self-assembled fibrils/fibers with natural characteristics, like D-band periodicity. These films were formed with different formation methodologies and on different substrates (mica, glass, PPS) depending on the required surface characteristics. For the investigation of the optical properties the films that were formed on mica were used due to its crystalline nature and its extremely flat surface enable the nanoscale imaging. The other two substrates (glass, PPS) allowed to be applied for the investigation of the adsorption of collagen fibers/fibrils on different substrates. The developed biological models were used as substrates for the growth of primary culture of human dermal fibroblasts. The results showed that the films can be used as cell culture substrates and that fibroblasts respond to the topography of the films. After films with oriented collagen fibers/fibrils were used, it was demonstrated that the fibroblasts followed the main orientation of the collagen fibers. Moreover, on films with randomly oriented fibers, the fibroblasts showed a no standard arrangement in the available space during their growth. In this PhD Thesis a method for simultaneous imaging of both the AFM fibroblasts and the collagen fibers was developed, so as to qualitatively present the relationship among the fibroblast orientation and the characteristics of the substrate. Also, in this specific field of research, this thesis presents for the first time the quantitative measurement and the graphical representation of the orientation (Circular histograms of local orientation (CHLO)) of collagen fibers in the nanoscale by applying AFM imaging methods and image processing techniques. In the case of studying the SHG signal, the biological surface/interface model and the experimental setups that were developed, they were used to investigate the possibility of producing SHG from thin films. Moreover, it was investigated the relationship between the polarization angle of the stimulation laser radiation and the orientation of the collagen fibers. In addition, thin films that were formed with thermal demodulated collagen, were used to correlate the SHG signal with the effects of thermal demodulation of the collagen fibers/fibrils. The results showed that the thin films are suitable for the detection and investigation of weak SHG signals, when the laser stimulation is performed with low intensities. Through the use of a polarizer, it was demonstrated that it was possible to detect the orientation of collagen fibers. Moreover, it was presented that the SHG signals were decreasing by the thermal denaturation of the collagen fibers. Therefore, the results demonstrated that measurements of the SHG signal can be used as a tool for detecting the orientation or alteration in the orientation of the collagen fiber/fibrils. These alterations may be observed in vivo in various pathological conditions and the SHG can be used as a diagnostic tool. Furthermore, the collagen-based biological surface model can be used as a tool for simulating these pathological alterations in order to clarify the exact relationship among the emitted SHG signal and the collagen characteristics. In the case of the ultraviolet radiation (UV, 254 nm), the thin collagen films allowed the exploration of the effects of UV irradiation on collagen optical properties of collagen (fluorescence, absorption) and its topography. Moreover, the use of the UV-irradiated collagen films as cell culture substrate was also investigated results showed that the used doses and irradiation times (which are in the range of those that are used for sterilization or for crosslinking processes) the fluorescence of collagen increases, while also the collagen absorption increase. These alterations in the fluorescence and absorption spectrum of collagen are due to the photo-degradation that was caused by UV radiation on fibrous collagen. The photo-degradation induced structural changes in aromatic amino acids residues or in the amino acids. More specifically, it caused the breaking of the peptides bonds and subsequently increased the formation of photoproducts from tyrosine and phenylalanine. When the irradiation was carried out directly on the collagen thin film for short irradiation intervals, the surface topography was not distorted (as no modifications were detected in the collagen fibers, like fibrous form, D-periodicity and diameter) or in the surface roughness. In the case that the films were formed by UV-irradiated collagen no lesions were observed in the collagen fibers/fibrils. Also, the surface roughness showed fluctuations, which suggests that the photo-degradation is a reversible process when the UV-irradiation takes place in wet environment. These results suggested that this method can be used as a technique for controlling/manipulating the surface roughness, which plays an important role in biomedical applications, especially when the surfaces are contacted with cells. Furthermore, the effects of UV irradiation for long irradiation intervals on nanoscale characteristics of collagen fibers and on the D-periodicity, were investigated. The results of the growth of primary cultures of human dermal fibroblasts on the thin collagen films -in both cases-, showed that the behavior of cells was affected by the UV irradiation. By increasing the irradiation time period, the body of fibroblasts and their nuclei became increasingly globular, which demonstrates abnormal growth of the fibroblasts. Consequently, the results of the thesis presented that UV-irradiated collagen-based biomaterials should be avoided or kept to the minimum possible level, when the bio-materials are intended to be used in applications where the biomaterials come into contact with cells. The last optical radiation that was investigated -with the use of the thin collagen films as a model, was the Low Level Laser radiation in the Red region (LLRL, 661 nm). The experimental results showed that although a slight increase in the emitted fluorescence intensity was measured, no alterations were observed in the nano-topography of collagen films after irradiation. It should be noted that the parameters of irradiation (wavelength, dose, irradiation time intervals) were of the order of magnitude as those used for the treatment with a low power laser (LLLT). The fact that the fibroblasts’ behavior was altered when the LLRL-irradiated films were used as substrate for the cultivation of cells is particularly interesting. By increasing the irradiation treatments (and consequently the irradiation dose offered in the collagen thin films), fibroblasts became more and more spherical. This is an evidence of abnormal growth of the fibroblasts, as it was also observed in the UV-irradiated films. This doctoral dissertation focused on the effects that LLRL had directly on collagen and it was the first time in the international literature that it was demonstrated that irradiation of LLRL may have a negative effect on cell growth due to the effects of irradiation on collagen. This result represents important and novel information that offers new data toward the clarification of the LLLT mechanism. Since the modulation of cellular behavior was observed in the absence of measurable surface changes, the alteration of cell behavior due to LLRL irradiation is not affected by the ‘surface guidance mechanism’ (which relies on the surface properties of the substrate). The results lead to a new dimension for investigating the involved phenomena and suggest that for the clarification of the LLLT mechanisms the investigation of the effects of LLRL (or other low power radiation) on other tissue properties (like the mechanicals) and on each separate tissue element is demanded. From this PhD thesis, important results concerning the model of the collagen fiber were obtained. Although the fibrous type I collagen has extensively been investigated and various models of its structure have been proposed, none of these models can explain all of the in vivo and in vitro observed structures. The results that were obtained showed that the developed protocols were suitable for the formation of collagen fibers presenting polymorphism, i.e. the existence of more than one periodicities along the fibers (e.g., the simultaneously occurrence of D- periodicities of the order of ~ 67 and ~ 100 nm). It is interesting that in the developed protocol the initial collagen solution consisted of a high concentration of collagen, without the addition of any other kind of substances that are traditionally used for the development of collagen fibers with polymorphism. Moreover, the use of the Spin Coating procedure allowed the formation of collagen fibers with kicks (areas along the fiber where the fiber is abruptly changes direction). The kicks were formed because of the large centrifugal forces that were exerted on the fibers and these mechanical deformations are similar to those of the tubes (structures of elongated shape and which are either empty inside or consist of a harder outer shell). Finally, upon irradiation with UV for long time intervals on the surface of the fibers ‘volcano-like’ holes were formed. AFM imaging allowed the visualization of the D-band within the fiber, i.e. below the damaged outer shell. The combination of these results leaded to a ‘multiple shells’ model of the collagen fiber according to which collagen fibers are behave as ‘tubes’ and consist of multiple shells, with the outside shell to be harder, and the D-periodicity to continue into the inner shells. The results of the research were qualitatively, quantitatively and theoretically evaluated and compared with the results presented in the relevant international literature. Based on the conclusions that were reached, it was shown that this dissertation contributes significantly to a wide range of research fields, concerning nano-characterization/nano-imaging of biomaterials and the optical radiation-biological tissue interactions. The obtained results received international recognition, while the developed techniques and models will be important tools in a number of research or biomedical applications, especially in the fields of nano-biomaterials and tissue engineering.